规模牛场产气荚膜梭菌耐药性及其ERIC-PCR指纹图谱分型

（泰安市岱岳区畜牧兽医局，山东泰安 271018）

规模牛场产气荚膜梭菌耐药性及其ERIC-PCR指纹图谱分型

钟召兵，王 宁，孙红华，杨夫会

（泰安市岱岳区畜牧兽医局，山东泰安 271018）

[目的]了解不同规模牛场分离的产气荚膜梭菌耐药性及其耐药基因分型，为临床治疗和感染控制提供依据。[方法]收集2014—2016年来自不同规模牛场分离的产气荚膜梭菌25株，采用K-B法检测其对9种常用抗生素的敏感性；应用基因间重复序列聚合酶链反应（ERIC-PCR），对菌株进行DNA分型及同源性分析。[结果]分离到25株产气荚膜梭菌；在耐药检测的9种药物中，耐药率超过50%的有4种，其中对庆大霉素耐药率最高（92%），其次是对青霉素（84%），而对氨苄青霉素耐药率最低（4%），对其余药物的耐药率在12%～52%之间；ERIC-PCR谱型表现为9个基因型（Ⅰ～Ⅸ），其中大部分来源于不同的克隆株，且有2个克隆株的相似度为100%。[结论]奶牛场的产气荚膜梭菌多重耐药现象比较严重，分子多样性复杂；产气荚膜梭菌来源广泛，不同地区、环境和条件下，同一种病原菌的基因型存在一定差异，可能存在多个基因型。

产气荚膜梭菌；耐药性；ERIC-PCR；分型；牛

产气荚膜梭菌是广泛分布于水、土壤、食物以及人和动物粪便和肠道中一种人兽共患病原体，在畜群中主要引起羔羊痢疾、牛羊“猝死症”、牛肠毒血症和绵羊软肾病[1]。据有关资料表明，近年来在我国流行的家畜“猝死症”大部分与产气荚膜梭菌感染有关[2]。近年来，该病的发病数量逐年增多，流行特点也由点状散发发展为片状散发，给我国养殖业造成了较大的经济损失[3]。传统的控制产气荚膜梭菌病的方法主要是应用抗生素和疫苗。但随着时间的推移，原先使用的抗生素和疫苗对畜群的保护率越来越低，导致产气荚膜梭菌病的暴发呈上升趋势。

本研究以规模奶牛场收集到的产气荚膜梭菌为实验材料，在药敏试验的基础上，应用基因间重复序列引物PCR（Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus Sequence-based PCR，ERICPCR）方法，分析其基因型及分子多态性，为指导规模牛场临床合理使用抗生素、科学修订防控方案以及控制耐药产气荚膜梭菌的传播提供依据。

1 材料与方法

1.1 菌株来源

样品为2014—2016年从不同规模牛场采集的产气荚膜梭菌25株，均为不重复株（表1）。实验前使用VTTEK-32全自动细菌分析仪系统，进行重新鉴定。质控菌株参考铜绿假单胞菌株ATCC27853，大肠埃希氏菌ATCC25922作为对照株。

表1 被研究的奶牛场情况

1.2 产气荚膜梭菌的药敏试验

采用美国临床和实验室标准协会（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）推荐的纸片扩散法（K-B法），选用以下抗生素的药敏纸片：氨苄青霉素、头孢噻肟、先锋霉素、诺氟沙星、阿米卡星、强力霉素、头孢他啶、青霉素、庆大霉素。结果判定及质量控制按2010年CLSI标准[4]进行（表2）。

表2 抗生素耐药标准

1.3 产气荚膜梭菌同源性检测

1.3.1 细菌总DNA的提取。按细菌基因组提取试剂盒操作说明书进行细菌DNA提取，提取后的产物于-20 ℃ 保存备用。

1.3.2 引 物 序 列[5]。E R I C 1：5´-ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC-3´；ERIC2：5´-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3´。以上所有引物由上海生工生物有限公司合成。

1.3.3 ERIC-PCR反应体系。10×PCR buffer （Mg2+free）2.5 µL，MgCl2（2.5 mmol/L）2 µL，dNTP（2.5 mmol/L）2.5 µL，上下游引物（25 µmol/L）各1 µL，模板DNA 2 µL，Taq DNA聚合酶（5 U/ µL）0.5 µL，用灭菌双蒸水补足25 µL。PCR基本反应程序为，预变性95 ℃ 4 min，94 ℃ 30 s，36 ℃1 min，68 ℃ 8 min，10个循环；变性温度上升到48 ℃和52 ℃时，分别设为15和10个循环，最后于68 ℃ 延伸16 min；琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色成像。

1.3.4 数据处理。每个样品的扩增带存在时赋值为“1”，不存在时赋值为“0”。用电泳图像分析软件（Gel Image System，Version 4.00） 自动生成矩阵图。采用非加权对数算术平均法（Unweighted pair group method using averages algorithm，UPGMA），利用NTSYS-pc 2.10软件构建聚类树状图。另外，每个分离株看作是一个分类学单位（Operational taxonomic unit，OUT），并且把相似性≥90%的菌株看作起源相同的菌株[6]。为减少误差，所有菌株在相同反应条件下一次完成，而且电泳也是在同一块凝胶中一次完成。

2 结果

2.1 产气荚膜梭菌分离株对常用药物的敏感性

分离的25株产气荚膜梭菌的耐药性情况见表3。参照《中华人民共和国兽药典》[7]，选取9种针对革兰氏阳性厌氧菌的药物，分别对分离的产气荚膜梭菌进行药敏试验。试验结果为：对庆大霉素的耐药性最强，耐药率达到了92%；其次为青霉素，耐药率为84%；再其次为强力霉素、诺氟沙星，耐药率均为52%；对其他药物的耐药率在4%～12%之间。

表3 25株产气荚膜梭菌对抗菌药物的耐药性

2.2 ERIC-PCR分型结果

25株产气荚膜梭菌菌株的ERIC-PCR指纹图谱的条带数为3～12，片段大小在0.1～4.5 kb之间。以相似系数0.8为分界线，25株产气荚膜梭菌可分为9个基因型，分别描述为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ型，其中Ⅴ型最多，有10株，占总菌株的40%，为主要流行型。8号、14号、15号、23号菌株各自单独成为1个型。15号与其余菌株指纹图谱差异较大，亲缘关系最远。所有产气荚膜梭菌菌株均有约1 000 bp 大小的特异性条带，最远亲缘关系为70%，17号与21号菌株亲缘关系最近，为100%（图1）。

3 讨论

图1 25株产气荚膜梭菌的ERIC-PCR聚类图

近年来，产气荚膜梭菌的分离率及耐药率不断上升，其在不同地区、不同规模畜禽场的耐药特征存在明显差异，常表现为多重耐药和泛药，已成为规模畜禽场的重要病原菌，且耐药性呈逐年上升趋势。本研究显示，25株临床分离的产气荚膜梭菌对庆大霉素耐药率最高（92%），青霉素次之（84%），对强力霉素、诺氟沙星耐药率居中（52%），对头孢噻肟（8%）、先锋霉素（8%）、头孢他啶（8%）等耐药率较低，对氨苄青霉素耐药率最低（4%）。因此，及时准确地检出耐药菌株，对建立和完善抗菌药物临床应用和细菌耐药预警机制具有十分重要的意义。

临床分离菌株的基因同源性分析，对于流行病学调查，特别是传染源和传播途径的追踪具有重要意义。ERIC-PCR是由Versalovic等[8]发展建立起来的，其原理是通过PCR扩增细菌基因的重复DNA片段，获得菌株特异性遗传图谱。ERIC片段中的回文特性以及能形成框架结构的特性是导致其具有高度保守、结构分散等多重功能的关键。它可以用1对或多对引物，通过计算机将ERIC-PCR的电泳图谱进行综合分析，准确反映菌株间基因组存在的差异，故可应用于不同种或不同型别菌株的同源性分析。倪学琴等[9]应用ERIC-PCR方法，把从健康鸡群中分离到的34株产气荚膜梭菌分为8个亚型，并证实ERIC-PCR和REP-PCR都能对该菌进行有效分型，但ERIC-PCR产生的条带更多，更适合产气荚膜梭菌的亚型分类。因此，ERICPCR作为一种行之有效的分子分型技术，为产气荚膜梭菌的流行病学调查提供了一个快捷的工具，有利于快速判断某个地区的流行菌株及其传播情况，从而为防控疫病提供重要参考[10]。

本实验在药敏试验的基础上，采用双引物ERIC-PCR法，对25株产气荚膜梭菌进行分型。根据ERIC电泳图谱中条带的数目及位置，经NTSYS统计软件聚类分析，得到遗传树状图。研究结果显示，25株产气荚膜梭菌ERIC-PCR指纹图谱条带数为3～12，片段大小在0.1～4.5 kb之间，可清晰分成9个基因型。菌株之间的遗传距离相同或接近，反映了这9个基因型中的菌株亲缘关系较近。其中来自同一奶牛场的17号与21号菌株的亲缘关系相同，其他大部分来源于不同的克隆株，其中Ⅴ型菌株数量最多，Ⅳ型和Ⅵ型次之，显示同种克隆株在不同规模牛场之间相互传播可能是造成规模牛场产气荚膜梭菌感染的主要原因之一。来自同一牛场不同个体或同一个体不同乳区的分离株，既存在相同的基因型，也存在不同的基因型（22号与23号菌株），而来自不同牛场的分离株也可能属于同一基因型（Ⅳ型与Ⅴ型）。此外，本次实验出现了少量遗传距离较远的、亲缘关系相差较大的菌株。这些研究结果提示：本地区奶牛场的产气荚膜梭菌多为同一基因型；在某个或某些牛群中存在某一产气荚膜梭菌的优势基因型；不同地区、环境和条件下，同一种病原菌的基因型也存在一定差异，可能存在多个基因型。

Microbiological Methods，2010，59：91-108.

[6] SNELLING A M，GERNER S P，HAWKEY P M，et al. Validation of Use of Whole-Cell Repetitive Extragenic Palindromic Sequence-Based PCR（REP-PCR）for Typing Strains Belonging to the Acinetobacter calcoaceticus-Acinetobacter baumannii Complex and Application of the Method to the Investigation of a Hospital Outbreak[J]. J Clin Microbiol，1996，34：1193-1202.

[7]中国兽药典委员会. 中国兽药典[M]. 北京：图书出版社，2010：附录99-102.

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[9]倪学琴，郑晓丽，曾东，等. 采用AFLP和ERIC-PCR技术研究规模化鸡场健康鸡群中产气荚膜梭菌的遗传多样性[J]. 畜牧兽医学报，2009，40（5）：717-724.

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（责任编辑：朱迪国）

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[3] 李勤凡，蒿彩菊，王建华. 牛猝死症研究进展[J]. 中国牛业科学，2002，28（5）：28-29.

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Drug Resistance of Clostridium Perfringens in Scale Dairy Farms and Fingerprint Typing Analysis by ERIC-PCR

Zhong Zhaobing，Wang Ning，Sun Honghua，Yang Fuhui
（Daiyue District Animal Husbandry and Veterinary Bureau，Tai'an，Shandong 271018）

[Objective]To recognize the drug resistance of Clostridium perfringens（C. perfringens）and to determine the genotype of resistance genes in different scale dairy farms，so as to provide the basis for clinical treatment and infection control.[Methods] Collecting 25 strains of C. Perfringens from different scale farms during 2014—2016，using K-B method to detect the sensitivity against 9 kinds of antibiotics，then conducting DNA typing tests by enterobacteriaceae intergenic repetitive sequence polymerase chain reaction（ERIC-PCR）and analyzing the genetic homology.[Results] 25 C. perfringens strains were isolated. Among the 9 kinds of antibiotics，4 of them had a drug resistance rate of over 50%. The drug resistance rate of the strains against Gentamicin was highest（ratio of 92%），followed by Penicillin（ratio of 84%），the lowest was Ampicillin（4%），and the rest was in the range from 12% to 52%. Besides，by means of ERIC-PCR， fi ngerprint typing analysis showed the isolated strains could be divided into 9 genotypes（Ⅰ～Ⅸ），most of which came from different clone strains，a similarity of 100% was found between two clones.[Conclusion] C. Perfringens with complex molecular diversity in dairy farms showed serious multiple drugresistance to antibiotics，these strains had an extensive source，and there was certain differences in the genotype of the same kind of C. Perfringens，possibly existing multiple genotypes.

C. perfringens；drug resistance；ERIC-PCR；genotype；cow

S852.6

A

1005-944X（2017）03-0087-04

10.3969/j.issn.1005-944X.2017.03.023

泰安市科技计划“奶牛高产高效繁育技术集成示范”（2016）