羊口疮病毒QD/2015株B2L基因克隆及生物信息学分析

李 智，仲 亮，张 静，刘春羽，范俊豪，王海峰，牛云雷，张七斤

（1. 内蒙古农业大学兽医学院，内蒙古呼和浩特 010018；2. 巴林左旗动物疫病预防控制中心，内蒙古赤峰 025450）

羊口疮病毒QD/2015株B2L基因克隆及生物信息学分析

李 智1，仲 亮1，张 静1，刘春羽1，范俊豪1，王海峰1，牛云雷2，张七斤1

（1. 内蒙古农业大学兽医学院，内蒙古呼和浩特 010018；2. 巴林左旗动物疫病预防控制中心，内蒙古赤峰 025450）

为分析羊口疮病毒（ORFV/QD/2015株）B2L基因的分子特征，预测其编码蛋白的生物学功能，对其B2L基因进行PCR扩增、克隆及序列测定，应用生物信息学相关软件及方法，对扩增所得的基因进行序列分析，并对其编码蛋白的二级结构、细胞抗原表位、三级结构、跨膜结构域和信号肽等进行预测和分析。结果显示：ORFV/QD/2015株B2L基因序列长1 137 bp，编码379个氨基酸；该毒株与其他12株羊口疮病毒参考株的B2L基因核苷酸序列同源性为96.8%～99.7%，氨基酸序列同源性为96.8%～99.2%。系统进化分析显示，ORFV/ QD/2015株与2015年分离到的ORFV/ShaanXi/2015/China株亲缘关系最近；B2L基因编码蛋白二级结构以α-螺旋区域和β-折叠区域所占比例较大，预测此蛋白可能存在7个细胞优势抗原表位，无跨膜区域，无信号肽区域；三级结构呈弯曲状螺旋结构。

羊口疮病毒；B2L基因；生物信息学分析；蛋白结构预测

羊口疮（ORF）是由羊口疮病毒（ORFV）引起的山羊和绵羊的一种急性、接触性传染病，人也可感染。本病以羊口唇等处的皮肤和粘膜形成红斑、丘疹、脓疮、溃疡和结痂等为主要特征[1]。ORFV全基因组大小为135～139 kb，是双链线性DNA病毒，基因组包含131个基因，其B2L基因位于基因组的左末端。ORFV在宿主细胞内增值时，其B2L基因在病毒DNA尚未复制时，便大量转录翻译为42 KDa大小的蛋白。该蛋白是ORFV外表囊膜的主要成分，可强烈刺激宿主免疫系统产生免疫应答[2]。目前国内关于ORFV B2L基因的生物信息学结构预测分析的报道较少。通过本试验可以了解ORFV/QD/2015流行株的生物信息学特征，充实ORFV分子流行病学资料，为下一步进行B2L基因的表达奠定基础。

1 材料与方法

1.1 病毒

羊口疮病毒株由涂明亮2015年从青岛市分离到，命名为ORFV/QD/2015。通过病毒滴度测定，其TCID50为10-5.5/0.1 mL。毒株由内蒙古农业大学传染病实验室保存。

1.2 细胞与菌株

DH5α感受态细胞购自天根生化科技（北京）有限公司。

1.3 主要试剂

2×Easy Taq SuperMix，购自北京全式金生物技术有限公司；氨苄青霉素（Ampicillin），购自AMERSCO公司；DL2000、PMDTM18-T Vector Cloning Kit，购自宝生物（大连）工程有限公司；病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒、凝胶回收试剂盒、质粒小提试剂盒，购自天根生化科技（北京）有限公司。其他试剂均为标准化学分析纯试剂。

1.4 主要设备

22331型PCR仪， 购 自德国Eppendorf公司；水平电泳仪BG-Power600i，购自BAYGENE公司；Syngene G：BOX凝胶成像仪，购自英国SYNGENE公司；恒温水浴锅，购自北京市长风仪器仪表公司；5417R型低温高速离心机，购自德国Eppendorf公司；恒温振荡培养箱（HZC-250），购自培英仪器公司。

1.5 引物设计与合成

根据GenBank中的ORFV B2L基因序列，利用primer 5.0，在基因保守区设计特异性引物[3]。引物由生工生物工程（上海）有限公司合成（表1）。

表1 B2l基因引物序列及产物大小

1.6 PCR扩增

采用病毒基因组DNA提取试剂盒，提取ORFV/QD/2015株全基因组，以提取的ORFV基因组为模板，用生理盐水作为阴性对照，用设计的B2L特异性引物对其进行PCR扩增。PCR扩增反应体系（25 µL）：2×Taq PCR Master Mix 12.5 µL，上游引物（10 µmol/L）1.0 µL，下游引物（10 µmol/L）1.0 µL， 模 板 DNA 1.0 µL，RNase-Free ddH2O 9.5 µL。PCR扩增反应参数：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，53 ℃退火45 s，72 ℃延伸30 s，35个循环，72 ℃终延伸10 min。将扩增得到的产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.7 基因克隆及序列分析

回收纯化的目的DNA片段，将其连接至PMD18-T载体上，然后转化到大肠杆菌DH5α感受态中；利用含氨苄青霉素抗性的LB平板，筛选阳性重组质粒；提取重组质粒，进行PCR和质粒双酶切鉴定；用1%琼脂糖凝胶电泳检测将鉴定为阳性的重组质粒命名为PMD18-T-B2L，送北京华大生物工程有限公司测序。参考GenBank上公布的ORFV B2L基因序列，利用DNAStar软件中的MegAlign程序，分析测序结果，构建进化树[4]。ORFV参考毒株信息见表2。

1.8 生物信息学分析

运用DNAStar软件中的Protean程序，使用Garnier-Robson、Chou-Fasman两种方法，分析预测ORFV/QD/2015株B2L基因编码蛋白的二级结构[5-6]；运用DNAStar软件中的Protean程序，分析预测该蛋白细胞抗原表位参数；运用SWISSMODEL预测该蛋白的三级结构；采用SignalP 4.1预测该蛋白信号肽；运用TMHMM Server 2.0 预测该蛋白跨膜结构域[7]。

表2 GenBank中ORFV参考毒株信息

2 结果与分析

2.1 PCR扩增

以提取的ORFV/QD/2015株DNA为模板，进行B2L基因特异性PCR扩增，然后经1%琼脂糖凝胶电泳分析，得到与预期相符、大小为1 137 bp的条带（图1）。

图1 ORFV/QD/2015株B2L基因PCR扩增产物电泳

2.2 测序结果

对质粒PCR和质粒双酶切鉴定为阳性的质粒进行测序，将测序结果进行拼接，其核苷酸序列见图2。由图2可知，B2L基因序列长为1 137 bp，可编码379个氨基酸。

图2 ORFV/QD/2015株B2L基因测序结果

2.3 ORFV/QD/2015株B2L基因核苷酸序列同源性分析

运用Clustal W法比对分析ORFV/QD/2015株B2L基因核苷酸序列与GenBank上公布的12株ORFV参考毒株B2L基因的核苷酸序列。结果表明，ORFV/QD/2015株B2L基因与其他12株ORFV参考株B2L基因的核苷酸序列同源性为96.8%～99.7%，其中与陕西省2015年分离到的毒株同源性高达99.7%（图3）。

图3 ORFV/QD/2015株B2L基因的核苷酸同源性分析

2.4 ORFV/QD/2015株B2L基因系统进化树分析

将ORFV/QD/2015株B2L基因核苷酸序列与GenBank上公布的12株ORFV参考株B2L基因的核苷酸序列构建进化树。结果表明，ORFV/ QD/2015株与陕西省2015年分离到的病毒株处于同一遗传进化分支，亲缘性最近（图4）。

图4 ORFV/QD/2015株B2L基因核苷酸序列系统进化树

2.5 ORFV/QD/2015株B2L基因氨基酸序列同源性分析

对ORFV/QD/2015株B2L基因氨基酸序列与GenBank上公布的12株ORFV参考株B2L基因氨基酸序列进行比对分析。结果表明，ORFV/ QD/2015株B2L基因氨基酸序列与其他12株ORFV参考株的B2L基因氨基酸序列同源性为96.8%～99.2%，其中与陕西省2015年分离到的和福建省2012年分离到的毒株B2L基因氨基酸序列同源性高达99.2%（图5）。

图5 ORFV/QD/2015株B2L基因氨基酸同源性分析

2.6 ORFV/QD/2015株B2L基因编码蛋白的二级结构预测

运用DNAStar程序中的Protean软件，使用Garnier-Robson和Chou-Fasman两种方法，分析ORFV/QD/2015株B2L基因编码蛋白的二级结构，结果显示，不同预测方法对蛋白二级结构的分析结果不完全相同。β-折叠和β-转角等特定结构的数目和所处位置有较大差异，Garnier-Robson方法分析该蛋白β-转角较少，并且几乎没有无规则卷区。结合两种算法，该蛋白α-螺旋位于18～28、37～47、64～76、92～99、155～160、218～229、244～248、256～266、314～318、329～337和357～371等区间，β-折叠位于14～17、34～37、48～50、80～83、106～108、128～132、139～146、147～150、166～173、179～187、191～195、200～206、211～215、235～239、241～244、252～256、270～278、297～309和342～349等区间，β-转角位于4～6、9～11、29～31、124～128、136～138、161～165、196～200和338～340等区间（图6）。

图6 ORFV/QD/2015株B2L基因编码蛋白二级结构预测与分析

2.7 ORFV/QD/2015株B2L基因编码蛋白细胞抗原表位参数预测

运用DNAStar程序中的Protean软件，综合分析预测ORFV/QD/2015株B2L基因编码蛋白细胞抗原表位参数。采用Kyte-D00little法分析亲水性，Karplus-Schulz法分析柔韧性，Jameson-Wolf法分析抗原指数，Emini法分析氨基酸表面可及性，结果显示，31～32、58～67、71～72、87～96、98～99、101～109、111～113、128～129、149～167、190～198、206～210、212～213、216～219、222～233、279～284、310～311、314～319、337～345、352～353、355～358和366～376位 氨 基酸亲水性较高；28～32、43～46、58～64、66～69、75～78、86～95、106～116、134～146、151～154、174～176、187～191、197～201、201～210、217～221、228～234、279～284、311～321、352～360和367～373位氨基酸柔韧性较高；9～15、30～32、42～45、57～79、86～98、107～116、150～154、160～165、172～178、206～210、217～223、226～233、265～271、278～285、291～297、309～321、323～329、338～342和 351～378位 氨基酸抗原指数较高；43～44、58～60、87～94、151～153、161～166、206～208、217～218、279～282、315～318、340～342和367～369位氨基酸表面可及性较高（图7）。

图7 ORFV/QD/2015株B2L基因编码蛋白细胞表位参数预测

运用DNAStar程序中的Protean软件，分析比较不同参考株之间的B2L基因编码蛋白的抗原指数。结果显示，ORFV/QD/2015株与5株参考毒株的B2L基因编码蛋白抗原指数较高的氨基酸位点基本一致（图8）。

2.8 ORFV/QD/2015株B2L基因编码蛋白的三级结构预测

利用SWISS-MODEL（http://swissmodel.expasy.org/interactive）预测ORFV/QD/2015株B2L基因编码蛋白的三级结构，结果显示该蛋白可能呈弯曲状螺旋结构（图9）。

图8 ORFV不同参考株间抗原指数比较

图9 ORFV/QD/2015 株B2L基因编码蛋白三级结构预测

2.9 ORFV/QD/2015株B2L基因编码蛋白的信号肽预测

采用SignalP 4.1（http://www.chs.dtu.dk/services/ SignalP/）预测ORFV/QD/2015株B2L基因编码蛋白信号肽，结果显示该蛋白无信号肽（图10）。

2.10 ORFV/QD/2015株B2L基因编码的蛋白的跨膜结构域预测

运 用 TMHMM Server V2.0（http://www.cbs. dtu.dk/services/TMHMM/）预测ORFV/QD/2015株B2L基因编码蛋白跨膜结构域，结果显示该蛋白并无跨膜结构域（图11）。

3 讨论

图10 ORFV/QD/2015株B2L基因编码蛋白信号肽预测

图11 ORFV/QD/2015株B2L基因编码蛋白跨膜结构域预测

目前，ORF广泛流行于全球各羊养殖国家或地区，且发生频率和流行范围呈逐年上升趋势。我国虽是农牧业大国，但由于对ORF缺乏关注，很多科研机构没有对该病开展理论研究，市场需求也较小，因此缺少相关ORF检测试剂盒。本研究通过对涂明亮分离到的ORFV/QD/2015株的B2L基因进行生物信息学研究，为进一步对该基因的表达和诊断试剂盒制备奠定了基础，同时也了解了当前ORFV/QD/2015株的生物信息学特征。

本研究将ORFV/QD/2015株B2L基因核苷酸序列和氨基酸序列与GenBank上公布的12株ORFV参考株B2L基因核苷酸序列和氨基酸序列分别进行比对分析发现：ORFV/QD/2015株B2L基因与其他12株参考株的B2L基因核苷酸序列同源性为96.8%～99.7%。其中，与2015年陕西省分离到的羊口疮病毒B2L基因核苷酸序列同源性高达99.7%；与其他12株参考株B2L基因的氨基酸序列同源性为96.8%～99.2%，其中与2015年陕西省和2012年福建省分离到的羊口疮病毒B2L基因氨基酸序列同源性高达99.2%。从进化树上可以看出，ORFV/QD/2015株与2015年陕西省分离到的ORFV处于同一遗传进化分支，因此认为涂明亮分离到的ORFV/QD/2015株与陕西株的亲缘性最近。

蛋白的二级结构中的α-螺旋和β-折叠的化学键能较高，能牢固地维持蛋白的高级结构，通常处于内部且不易变形，不利于抗原抗体的结合，而转角和无规则卷曲的区域结构比较松散，稳定性差，易发生扭曲变构，多处于蛋白质分子表面，容易与抗体分子接近及结合[7-8]。该蛋白α-螺旋和β-折叠所占比例较大，几乎没有无规则卷曲，所以该蛋白是否有良好的反应原性有待验证。该蛋白无跨膜结构域和信号肽是非分泌性蛋白，因此预测蛋白的生物学特征时，通过单一参数的确定是不准确的，还需要同时考虑亲水性、表面可及性、抗原指数和柔韧性等参数[9-10]。本研究经综合考虑，选取亲水性高、柔韧性好、表面可及性大、抗原指数高的区域作为候选抗原表位，并兼顾二级结构各参数，比较了不同参考株B2L基因编码蛋白的抗原指数，最终推测出ORFV/QD/2015株B2L基因编码蛋白的细胞优势抗原表位区域为58～69、86～95、205～211、216～219、279～284、311～321和352～378位氨基酸[11-12]，认为该蛋白有一定的免疫原性。这些抗原优势表位区域的确定，为以后表达该蛋白提供了参考，但其蛋白免疫原性和反应原性如何，还需要通过实验进一步验证[13]。

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（责任编辑：朱迪国）

Cloning and Bioinformatic Analysis of B2L Gene of Orf Virus QD/2015 Strain

Li Zhi1，Zhong Liang1，Zhang Jing1，Liu Chunyu1，Fan Junhao1，Wang Haifeng1，Niu Yunlei2，Zhang Qijin1
（1. College of Veterinary Medicine，Inner Mongolia Agricultural University，Hohhot，Inner Mongolia 010018；2. Baarin Left Banner Animal Disease Prevention and Control Center，Chifeng，Inner Mongolia 025450）

In order to analyze molecular characteristics of B2L gene of Orf virus（ORFV/QD/2015） strain and to predict biological function of B2L protein. In this study，the B2L gene was ampli fi ed，cloned and sequenced. Using related bio-informatics softwares and methods，the amplified sequence was analyzed and B2L protein's secondary structure，tertiary structure，B-cell preponderant epitope，conserved domain，transmembrane domain and signal peptide were also predicted and analyzed. Results showed that the length of B2L gene was 1 137 bp，encoding 379 amino acids. The B2L gene of ORFV/QD/2015 strain shared amino acid identities of 96.8%～99.2% and nucleotide identities of 96.8%～99.7%，respectively，compared with other 12 ORFV reference strains. Phylogenetic analysis indicated a closest relationship between ORFV/QD/2015 strain and ORFV/ShaanXi/2015/China strain，the latter was isolated in 2015. Prediction of secondary structure of B2L protein indicated α-helix and β-sheet took up a large proportion.，and B2L protein possibly contained 7 potential antigen epitopes. However，no transmembrane domain or signal peptide was identi fi ed. The tertiary structure of B2L protein was curved spiral structure.

ORFV；B2L gene；bioinformatics analysis；prediction of protein structure

S852.65

B

1005-944X（2017）03-0091-06

10.3969/j.issn.1005-944X.2017.03.024