2型糖尿病并发肺结核患者血清中炎症细胞因子水平变化的研究

李雨泽 刘玉琴 陈向丽 侯绍英 Hayder 姜辉 李殿忠

·论著·

2型糖尿病并发肺结核患者血清中炎症细胞因子水平变化的研究

李雨泽 刘玉琴 陈向丽 侯绍英 Hayder 姜辉 李殿忠

目的 探讨2型糖尿病并发肺结核(type 2 diabetes mellitus complicated with pulmonary tuberculosis，T2DMTB)患者血清中炎症细胞因子Toll样受体4(toll-like receptor 4，TLR4)和脂多糖受体14(lipopolysaccharide receptor 14，LPS受体14；又称CD14)水平的变化。方法 选取2014年9月至2015年6月在黑龙江省传染病防治院就诊的T2DMTB患者40例(T2DMTB组)，2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)患者40例(T2DM组)，以及体检科筛查出的健康者40名(对照组)作为研究对象。收集研究对象的人口学特征资料，并抽取清晨空腹静脉血3～4 ml。采用酶联免疫吸附试验检测研究对象血清中TLR4和CD14的水平，并进行比较。结果 对照组、T2DM组和T2DMTB组血清中TLR4水平分别为(10.21±2.29) ng/ml、(19.40±1.80) ng/ml、(15.27±2.52) ng/ml，三组间比较差异有统计学意义(F=76.33，P<0.01)；进一步的两两比较显示，T2DM组和T2DMTB组均高于对照组，T2DMTB组低于T2DM组，差异均有统计学意义(P值均<0.01)。对照组、T2DM组和T2DMTB组血清中CD14水平分别为(9.17±1.62) ng/ml、(16.48±1.54) ng/ml、(10.86±1.65) ng/ml，三组间比较差异有统计学意义(F=113.92，P<0.01)；进一步的两两比较显示，T2DM组和T2DMTB组均高于对照组，T2DMTB组低于T2DM组，差异均有统计学意义(P值均<0.01)。结论 T2DMTB组血清中TLR4和CD14水平高于对照组，而低于T2DM组；T2DMTB患者血清中TLR4和CD14水平变化，对T2DMTB的发病机制有提示作用。

结核； 肺； 糖尿病，2型； 炎症趋化因子类； 评价研究

结核病是严重危害公众健康的公共卫生问题，我国结核病负担很重，全国≥15岁人口中活动性肺结核患者预计可高达499万例[1]。文献报道显示，2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)患者较正常人更容易患肺结核[2]。2型糖尿病并发肺结核(type 2 diabetes mellitus complicated with pulmonary tuberculosis，T2DMTB)患者多表现为肺部病变重、病情进展快、原发耐药多和预后差。因此，探索T2DMTB的发病机制，寻找T2DM患者中肺结核高危人群，进而早期预防与治疗已成为亟待解决的问题。目前认为，T2DM是一个慢性炎症的病理过程[3-4]，而肺结核也是公认的慢性感染性疾病。Toll样受体4(Toll-like receptor 4，TLR4)是机体天然免疫屏障中作用机制最明确的Toll样家族相关受体，可在包括巨噬细胞、树突状细胞及胰岛细胞等在内的免疫和非免疫细胞中表达，并在天然免疫防御中发挥关键作用[5-6]。此外，当病原体入侵机体时，机体最先识别的就是病原体相关分子模式(pathogen associated molecular pattern，PAMP)，而脂多糖受体14(lipopolysaccharide receptor 14，LPS受体14；又称CD14)已被证实可以使TLR4与PAMP的亲和力增强，从而同样发挥免疫防御作用[7-8]。TLR4、CD14水平的改变与健康人群T2DM[9-10]或肺结核[11-12]患病相关，但T2DMTB患者这些炎症细胞因子水平改变的情况尚不明确。因此，笔者选取我国东北地区的汉族人群(人群限定是为后续基因测序做准备)，比较T2DM、T2DMTB及健康人群血清中炎症细胞因子TLR4、CD14水平，探讨血清炎症细胞因子水平的改变与T2DMTB发病的关联。

对象和方法

1.对象：选取2014年9月至2015年6月在黑龙江省传染病防治院就诊的T2DMTB患者40例(T2DMTB组)，T2DM患者40例(T2DM组)，以及体检科筛查出的健康者40名(对照组)作为研究对象。收集研究对象人口学特征及相关临床检测指标。研究对象均抽取清晨空腹静脉血3～4 ml (使用乙二胺四乙酸抗凝)，分离血清，-20 ℃保存待测。本研究经过黑龙江省第四医院伦理委员会的审核，研究对象均签署知情同意书。

2.纳入标准：所有研究对象均为中国黑龙江省汉族人群(限定“民族”为后续基因多态性研究做准备)，民族判定以现场家族史询问及身份证为准。(1)T2DMTB组：研究对象为已患T2DM且初次诊断为并发肺结核患者，其符合T2DM和肺结核的诊断标准。T2DM的诊断参照文献[13]，即有明显的糖尿病典型症状(包括多饮、多食、多尿、体质量下降)，并满足以下任意一条件：①任意时间血糖≥11.1 mmol/L；②空腹血糖≥7.0 mmol/L；③空腹血糖≥7.0 mmol/L且口服葡萄糖耐量试验(oral glucose tolerance test，OGTT)2 h血糖≥11.1 mmol/L。肺结核诊断参照文献[14]。(2)T2DM组：研究对象符合T2DM诊断标准[13]，且根据肺结核诊断标准[14]确定未患肺结核者。(3)对照组：研究对象为无肺结核既往史、无糖尿病家族史，生化全项、血常规、糖化血红蛋白、尿常规、尿微量白蛋白等检查均正常的健康人群。

3.排除标准：并发艾滋病、病毒性肝炎(乙型和丙型)、梅毒、肿瘤、结缔组织病及其他内分泌疾病的患者；非中国黑龙江省汉族人群。

4.细胞因子水平测定：血清中TLR4和CD14采用酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)进行测定，所用试剂盒均购自北京诚林生物制品有限公司。不同批次试剂盒无交叉使用。每次实验标准品线性回归与预期浓度相关系数R2均大于 0.99。实验进行2次，取平均值。

结 果

1.基本信息：对照组、T2DM组和T2DMTB组间研究对象在性别、年龄及身高方面的差异均无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 研究对象人口学特征在各组间分布情况

2.细胞因子水平：经ELISA检测研究对象血清中TLR4水平，对照组、T2DM组和T2DMTB组间差异有统计学意义；血清中CD14水平，3组间差异也有统计学意义(表2)。进一步的组间两两比较显示，血清TLR4水平T2DM组和T2DMTB组均高于对照组，T2DMTB组低于T2DM组，差异均具有统计学意义(P值均<0.01)；血清CD14水平，T2DM组和T2DMTB组均高于对照组，T2DMTB组低于T2DM组，差异均有统计学意义(P值均<0.01)。

表2 各组研究对象血清TLR4和CD14受体水平

讨 论

病原体微生物中具有的结构恒定又进化比较保守的分子结构被定义为PAMP。PAMP包括LPS、蛋白聚糖(proteoglycan，PG)、脂阿拉伯甘露糖(lipoarabinomannan，LAM)等。TLR4识别结核分枝杆菌病原体细胞壁LAM后触发各种细胞内信号转导通路[15]，最终导致机体产生天然免疫。CD14参与并增强了TLR4的识别和再结合结核分枝杆菌的能力。所以，研究TLR4及CD14与T2DMTB发病的关系有着非常重要的意义。

本次研究中，各组研究对象年龄、性别、身高间差异无统计学意义，减少了混杂因素。各组研究对象血清中TLR4水平从低到高依次为对照组、T2DMTB组及T2DM，其中，T2DM组高于对照组和T2DMTB组，T2DMTB组高于对照组。各组血清中CD14水平也具有相同的趋势。T2DM组血清中TLR4及CD14水平均高于对照组也进一步证明了T2DM本身就是慢性炎症过程。炎性反应可以使得Toll样受体下游核因子κB (nuclear factor-κB，NF-κB)被激活，其活化后又可促进肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-alpha，TNF-α)转录，加剧包含胰岛细胞在内的氧化应激，导致T2DM的发生[16]。本结果也与一些其他研究报道一致。Singh等[17]研究发现，T2DM患者血清中LPS及TLR4均有升高；杨孟雪等[18]发现，肥胖糖尿病患者血清中TLR4升高，而且NF-κB被激活，为正反馈炎性反应过程。

TLR4是Toll受体之一，T2DM所导致机体长期处于慢性炎性的过程可能会使得活性受体数量减少。CD14不能单独激活巨噬细胞吞噬病原体，而要与其他因子结合后才能够增强TLR4功能。所以，这可能是T2DMTB患者TLR4、CD14水平较T2DM患者降低的原因之一。T2DMTB组TLR4和CD14水平虽较T2DM组低，但较对照组高，说明T2DMTB是感染性疾病，患者机体会伴随炎症反应过程TLR4和CD14水平升高。血清中Toll样受体家族的TLR4和CD14水平变化提示了TLR4、CD14与T2DMTB发病有关，而T2DMTB患者血清中TLR4和CD14水平低于T2DM患者，可能是T2DMTB发病的关键。

T2DM患者并发肺结核会导致传染源增多，受威胁人群增多，结核患病风险增大。同时，T2DMTB治疗和控制也是临床工作中面临的新挑战。本研究的创新之处就是对T2DMTB的发病机制进行探究，并根据大量临床及科研经验选择TLR4和CD14对T2DMTB的发病机制进行推断。但因本研究仅为临床观察性研究，所得证据强度较弱，仅对病因有提示作用，无法深入阐述病因机制。

单纯用环境因素不仅无法解释糖尿病和结核病两种看似发病机制相互矛盾的疾病能同时发生于同一个机体的原因，也无法解释临床工作中常见的糖尿病家族成员虽在同一环境中均有结核分枝杆菌接触史，但并不共同患结核病的现实。这些实际工作中的发现促使我们不得不从遗传学方面考虑糖尿病并发肺结核的病因。基因多态性可以影响基因转录激活，从而改变细胞因子的产生水平。基因多态性的存在并不会直接导致某种疾病的发生，但会使得个体在某种特殊环境或其他危险因素存在时疾病易感性发生改变。因此，笔者下一步将从细胞因子的基因多态性层面进行研究，以进一步探索糖尿病患者结核病易感性的遗传学病因。

[1] 全国第五次结核病流行病学抽样调查技术指导组, 全国第五次结核病流行病学抽样调查办公室. 2010年全国第五次结核病流行病学抽样调查报告. 中国防痨杂志, 2012, 34(8):485-508.

[2] 罗凯. 肺结核合并糖尿病的防治. 临床肺科杂志, 2011, 16(1): 91-92.

[3] Varadaradjalou S, Féger F, Thieblemont N, et al. Toll-like receptor 2 (TLR2) and TLR4 differentially activate human mast cells. Eur J Immunol, 2003, 33(4): 899-906.

[4] Pickup JC, Crook MA. Is type Ⅱ diabetes mellitus a disease of the innate immune system? Diabetologia, 1998, 41(10): 1241-1248.

[5] Medzhitov R, Preston-Hurlburt P, Janeway CA Jr. A human homologue of the Drosophila Toll protein signals activation of adaptive immunity. Nature, 1997, 388 (6640): 394-397.

[6] Takeda K, Akira S. TLR signaling pathways. Semin Immunol, 2004, 16(1):3-9.

[7] Shimazu R, Akashi S, Ogata H, et al. MD-2, a molecule that confers lipopolysaccharide responsiveness on Toll-like receptor 4. J Exp Med, 1999, 189(11): 1777-1782.

[8] Andrade BB, Singh A, Narendran G, et al. Mycobacterial antigen driven activation of CD14++CD16-monocytes is a predictor of tuberculosis-associated immune reconstitution inflammatory syndrome. PLoS Pathog, 2014, 10(10): e1004433.

[9] Hotamisligil GS. Inflammation and metabolic disorders. Nature, 2006, 444(7121): 860-867.

[10] Lumeng CN, Deyoung SM, Bodzin JL, et al. Increased inflammatory properties of adipose tissue macrophages recruited during diet-induced obesity. Diabetes, 2007, 56(1): 16-23.

[11] Reiling N, Hölscher C, Fehrenbach A, et al. Cutting edge: Toll-like receptor (TLR)2- and TLR4-mediated pathogen recognition in resistance to airborne infection withMycobacteriumtuberculosis. J Immunol, 2002, 169(7): 3480-3484.

[12] 吴语宁. 人结核病患者血清特异性抗体与CD14基因多态性相关性的初步研究. 长春:吉林农业大学, 2013.

[13] 钱荣立. 关于糖尿病的新诊断标准与分型. 中国糖尿病杂志, 2000, 8(1): 5-6.

[14] 中华人民共和国卫生部. 肺结核诊断标准(WS288-200). 北京: 中华人民共和国卫生部, 2008.

[15] Strohmeier GR, Fenton MJ. Roles of lipoarabinomannan in the pathogenesis of tuberculosis. Microbes Infect, 1999, 1(9): 709-717.

[16] Kaisho T, Akira S. Toll-like receptor function and signaling. J Allergy Clin Immunol, 2006, 117 (5): 979-987.

[17] Singh A, Boden G, Rao AK. Tissue factor and Toll-like receptor (TLR) 4 in hyperglycaemia-hyperinsulinaemia. Effects in healthy subjects, and type 1 and type 2 diabetes mellitus. Thromb Haemost, 2015, 113(4): 750-758.

[18] 杨孟雪, 杨波, 李显文, 等. 肥胖症伴糖尿病患者血清对人源单核细胞TLR4/NF-κB信号通路的影响. 中南大学学报(医学版), 2014, 39(9): 917-923.

(本文编辑：李敬文)

Association between serum levels of inflammatory cytokines toll-like receptor 4 and lipopolysaccharide receptor 14 and occurrence of type 2 diabetes mellitus complicated with pulmonary tuberculosis

LIYu-ze*,LIUYu-qin,CHENXiang-li,HOUShao-ying,Hayder,JIANGHui,LIDian-zhong.

*HeilongjiangProvincialTuberculosisControlCenter,Harbin150500,China

s:JIANGHui,Email：jianghui7722@163.com;LIDian-zhong,Email：lidianzhong2010@163.com

Objective To investigate the relationship between serum levels of inflammatory cytokines Toll-Like receptor 4 (TLR4), lipopolysaccharide receptor 14 (LPS receptor) and type 2 diabetes mellitus complicated with tuberculosis (T2DMTB). Methods We recruited 40 cases with T2DMTB and type 2 diabetes mellitus (T2DM) respectively, and 40 cases of healthy people from the Heilongjiang province fourth hospital between September 2014 and June 2015. The demographic characteristics of the subjects were collected. In addition, 3 to 4 ml venous blood was collected in the early morning. The serum levels of TLR4 and CD14 were measured by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and compared. Results The serum grades of TLR4 in the control group, T2DM group and T2DMTB group were (10.21±2.29) ng/ml, (19.40±1.80) ng/ml and (15.27±2.52) ng/ml, respectively. The differences among the three groups were significant (F=76.33,P<0.01). The serum grades of CD14 in the control group, T2DM group and T2DMTB group were (9.17±1.62) ng/ml, (16.48±1.54) ng/ml and (10.86±1.65) ng/ml, respectively. The differences among the three groups were significant (F=113.92,P<0.01). The serum grades of TLR4 and CD14 in T2DM and T2DMTB groups were significantly higher than healthy control group, but the serum levels of TLR4 and CD14 in T2DMTB group was significantly by compared with T2DM group (P<0.05). Conclusion The serum levels of TLR4 and CD14 in T2DMTB group were higher than those in control group, but lower than that in T2DM group. The changes of the serum levels of TLR4 and CD14 with T2DMTB suggest that they play an important prompt role on the pathogenesis of T2DMTB.

Tuberculosis； Pulmonary； Diabetes mellitus； Type 2； Chemokines； Evaluation studies

10.3969/j.issn.1000-6621.2017.02.008

黑龙江省卫生厅科研项目(2012-432)

150500 哈尔滨，黑龙江省传染病防治院(李雨泽、刘玉琴、姜辉、李殿忠)；哈尔滨医科大学公共卫生学院[陈向丽(硕士研究生)、侯绍英]；哈尔滨工业大学[Hayder(伊拉克籍硕士研究生)]

姜辉，Email：jianghui7722@163.com；李殿忠，Email：lidianzhong2010@163.com

2016-11-13)