藤本豆豆荚总黄酮对小鼠免疫功能的影响

曹柏营 姜秀娟 戚颖欣 昌友权

(吉林工程技术师范学院食品工程学院，吉林 长春 130052)

藤本豆豆荚总黄酮对小鼠免疫功能的影响

曹柏营 姜秀娟 戚颖欣 昌友权

(吉林工程技术师范学院食品工程学院，吉林 长春 130052)

研究藤本豆豆荚总黄酮对正常小鼠免疫功能及体内抗氧化活性的影响。以小鼠免疫器官系数、脾淋巴细胞增殖活性、巨噬细胞吞噬能力、细胞因子水平、血清SOD、GSH-Px和MDA为指标评价藤本豆豆荚总黄酮的免疫功能和体内抗氧化活性。结果表明，与阴性对照组比较，灌胃给予正常小鼠藤本豆豆荚总黄酮30 d后，小鼠胸腺系数和脾脏系数分别增加12.34%和8.67%，小鼠脾脏淋巴细胞的增殖活性和巨噬细胞的吞噬能力分别增加114.68%和27.16%，小鼠血清IFN-γ、AKP、SOD和GSH-Px的活性分别提高8.25%，82.52%，10.47%，12.16%，血清MDA水平降低32.97%。藤本豆豆荚总黄酮具有增强正常小鼠免疫功能和体内抗氧化活性的作用。

藤本豆；豆荚；黄酮；免疫功能；抗氧化活性

多年生藤本豆是野生扁豆与大油豆杂交得到的植物新品种，藤本豆蛋白、多糖、多肽和黄酮类化合物具有调节免疫[1]、降低血清胆固醇[2-3]、抗氧化的作用[4]。植物黄酮类化合物的药理作用包括降血脂、清除自由基、抗氧化作用、免疫调节作用、抗骨质疏松等，是保健食品的重要功效成分之一[5]。植物黄酮类化合物可通过特异性免疫和非特异性免疫发挥免疫调节作用[6]。藤本豆豆荚是藤本豆加工过程中的废弃物，其豆荚中含有丰富的黄酮类化合物，由于其提取率和纯度相对较低，一定程度上限制了植物黄酮的工业化生产和应用[7-8]。因此本研究以藤本豆豆荚为原料提取总黄酮，利用大孔吸附树脂进行纯化，提高了黄酮类化合物的提取率和纯度，并对其免疫功能和体内抗氧化活性进行评价，旨在为藤本豆资源的综合利用及保健食品的开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

藤本豆豆荚：采自福建省永春县岵山镇藤本豆种植示范基地，采后自然晾干，临用时烘箱(60℃)干燥后粉碎备用；

昆明雌性小鼠：4周龄，SPF级，体重22～25 g，许可证号scXK(吉)2011-0013，长春生物制品研究所有限责任公司。

1.2 试验试剂

伴刀豆蛋白A(ConA)：纯度99%，美国Sigma公司；

二甲基亚砜：分析纯，天津市致远化学试剂有限公司；

RPMI-1640培养基、Hank’s液：美国Sigma公司；

MTT：纯度98%，美国Sigma公司；

胎牛血清：优级纯，生工生物工程(上海)股份有限公司；

碱性磷酸酶(AKP)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、小鼠IFN-γ、IL-4 ELISA检测试剂盒：南京建成生物工程研究所；

其他试剂均为分析纯。

1.3 试验仪器

可见分光光度计：WFJ2100型，尤尼柯(上海)仪器有限公司；

酶标仪：SPECTRA MAX 190型，美国Molecular Devices公司；

CO2培养箱：SHELLAB2406-2型，美国希尔顿制造股份有限公司；

高速冷冻离心机：Z36HK型，德国Hermle公司。

1.4 试验方法

1.4.1 藤本豆豆荚总黄酮的提取 藤本豆豆荚粉(过60 目)，按1∶10(g/mL)加入60%乙醇水溶液，水浴(90℃)回流提取3 h，过滤，滤渣再按1∶10(g/mL)加入60%乙醇水溶液，水浴(90℃)回流提取2 h，过滤，合并滤液备用。藤本豆豆荚总黄酮得率计算：

(1)

式中：

R——藤本豆豆荚总黄酮得率，%；

a——吸光度值；

m——称取样品质量，g。

1.4.2 藤本豆豆荚总黄酮的纯化 选用AB-8树脂对藤本豆豆荚总黄酮粗提物进行纯化，处理后的树脂装入层析柱(5 cm×60 cm)，上样流速为2 BV/h，洗脱溶剂为60 mL/100 mL 乙醇水溶液，洗脱流速为2 BV/h。纯化后冻干备用。

1.4.3 动物试验

(1) 试验动物分组及给药：4周龄昆明小鼠(22～25 g)适应性饲养3 d后随机分为4组，每组30只。阴性对照组(生理盐水200 mg/kg)、藤本豆豆荚总黄酮纯化物高剂量组(400 mg/kg)、中剂量组(200 mg/kg)、低剂量组(100 mg/kg)。试验期间小鼠自由饮水、采食，每天灌胃给药一次。连续给药30 d，期间每隔10 d随机选取10只进行免疫指标的检测。

(2) 小鼠胸腺系数和脾脏系数的测定：小鼠眼球取血后颈椎脱臼处死，解剖取其胸腺和脾脏，用滤纸吸干表面血污，称重，按式(1)计算胸腺系数和脾脏系数(mg/g)。

(2)

(3) 小鼠腹腔巨噬细胞吞噬能力测定：小鼠腹腔巨噬细胞吞噬能力测定采用中性红吞噬试验测定。具体检测方法参照刘文辉等[9]的试验方法。吞噬能力以OD540 nm值表示，其值越大代表吞噬能力越强。

(4) T淋巴细胞增殖能力测定：T淋巴细胞增殖能力测定参照Chalamaiah等[10]的试验方法。增殖能力以OD570 nm值表示，其值越大代表增殖能力越强。

(5) 血清生化指标测定：小鼠眼球取血后，3 000 r/min离心取血清，严格按试剂盒操作说明，分别测定血清AKP、SOD、GSH-Px、MDA、IFN-γ、IL-4等指标。

1.5 数据处理

2 结果与分析

2.1 藤本豆豆荚总黄酮纯化

藤本豆豆荚总黄酮提取得率可达到6.42%，提取率高于香薷中的总黄酮(5.36%)[11]。经AB-8大孔吸附树脂纯化后，总黄酮纯度达到35.73%，提高了4.5倍，与玉竹总黄酮的纯化效果相当[12]。

2.2 藤本豆豆荚总黄酮对小鼠胸腺和脾脏系数的影响

动物免疫器官的发育与机体的免疫能力密切相关，免疫器官是免疫细胞发育和增殖的场所，同时也是执行免疫功能的重要机构[13]。胸腺和脾脏是动物体内的两个重要的免疫器官，胸腺对T细胞分化、成熟起到重要作用[14]；脾脏内含有大量的免疫细胞，包括T细胞、B细胞、巨噬细胞和NK细胞等。因此免疫器官的发育状况成为免疫功能评价的重要指标之一。

由图1(a)可知，给药第10天，与阴性对照组比较，中、高剂量组可极显著增加小鼠胸腺系数(P<0.01)，分别增加了4.69%和5.86%；给药第20天和第30天，中剂量组小鼠胸腺系数显著增加(P <0.05)，分别增加了6.19%和9.71%；高剂量组小鼠胸腺系数极显著增加(P <0.01)，分别增加了8.17%和12.34%。由图1(b)可知，给药第10天，中、高剂量组极小鼠脾脏系数显著增加(P <0.01)，分别增加了4.5%和7.06%；第20天，中剂量组小鼠脾脏系数显著增加(P <0.05)，增加了3.5%，高剂量组小鼠脾脏系数极显著增加(P<0.01)，增加了6.64%；第30天，低、中和高剂量组小鼠脾脏系数都显著增加，分别增加了3.83%，6.05%，8.67%。藤本豆豆荚总黄酮可促进小鼠胸腺和脾脏的发育，增加胸腺和脾脏的相对质量，金银花黄酮也表现出相似的作用[15]。

*. 与阴性对照组比较P<0.05 **. 与阴性对照组比较P<0.01

2.3 藤本豆豆荚总黄酮对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬能力的影响

巨噬细胞能吞噬异物、处理抗原，是构成机体非特异性免疫的重要组成部分，吞噬细胞活性的大小反映机体非特异性功能的强弱[16]。

由图2可知，与阴性对照组比较，给药10，20，30 d后，高、中和低剂量组的巨噬细胞吞噬活性都极显著增加(P<0.01)，给药30 d高剂量组吞噬活性增加114.68%，同时表现出一定的剂量反应效应，随黄酮浓度的增大，巨噬细胞的吞噬活性增加，高剂量组表现出最高的吞噬活性。藤本豆豆荚总黄酮能通过提高巨噬细胞的吞噬活性来增强小鼠的非特异性免疫功能，蕨菜黄酮也可增强小鼠的非特异性免疫功能[17]。

*. 与阴性对照组比较P<0.05 **. 与阴性对照组比较P<0.01

2.4 藤本豆豆荚黄酮对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响

淋巴细胞受抗原物质刺激后可分化增殖、产生特异性免疫应答或抗体，是细胞免疫的重要细胞，淋巴细胞增殖试验是评价细胞免疫的重要指标之一[18]。

由图3可知，与阴性对照组比较，给药10，20，30 d后，高、中和低剂量组黄酮都能极显著促进小鼠脾淋巴细胞的增殖(P<0.01)，给药30 d高剂量组淋巴细胞增殖能力提高27.16%，并呈现剂量依赖关系，随剂量的增加，增殖作用逐渐增强。藤本豆豆荚总黄酮能刺激小鼠脾淋巴细胞增殖，增强小鼠的细胞免疫功能，黄芪黄酮也可显著促进小鼠脾淋巴细胞的增殖[19]。

*. 与阴性对照组比较P<0.05 **. 与阴性对照组比较P<0.01

2.5 藤本豆豆荚黄酮对小鼠血清细胞因子IFN-γ和IL-4的影响

Th细胞可分泌不同的细胞因子，维持机体正常的免疫功能，其中Th1属于促炎因子，通过表达TNF-α和IFN-γ来促进细胞免疫和抑制体液免疫；Th2属于抑炎因子，通过分泌IL-4、IL-6和IL-10来促进体液免疫和抑制细胞免疫[20]。

由图4(a)可知，与阴性对照组比较，低、中和高剂量组都可显著增加小鼠血清中IFN-γ因子的表达(P<0.01)，给药30 d高剂量组可增加8.25%，并呈现一定的剂量效应关系；由图4(b)可知，给药10 d后，高剂量组可显著增加小鼠血清中IL-4的表达(P<0.05)，其他各给药组都无显著性差异。藤本豆豆荚总黄酮可诱导机体的炎症性反应，明显增加IFN-γ的表达，诱导Th1/Th2平衡向Th1方向偏移，促进机体的细胞免疫而抑制体液免疫，白花舌草也表现出相同的免疫活性[21]。

*. 与阴性对照组比较P<0.05 **. 与阴性对照组比较P<0.01

2.6 藤本豆豆荚黄酮对小鼠血清AKP活力的影响

碱性磷酸酶(AKP)在细菌等异物的消化降解过程中发挥重要作用，另外AKP可增强机体对病原体的识别和吞噬能力，是免疫学研究的关键指标之一[22]。

由图5可知，与阴性对照组比较，给药10，20，30 d后，高、中和低剂量黄酮组都可显著提高小鼠血清AKP的浓度(P<0.01)，给药30 d高剂量组小鼠血清AKP活力增加82.52%，高于金银花黄酮高剂量组(12.73 U/100 mL)[15]。藤本豆豆荚总黄酮可提高小鼠血清AKP的活性，在调节小鼠免疫功能中发挥重要作用。

*. 与阴性对照组比较P<0.05 **. 与阴性对照组比较P<0.01

2.7 藤本豆豆荚黄酮对小鼠血清SOD和GSH-Px活性的影响

机体内活性氧(ROS)水平过高会导致细胞坏死，进而导致机体免疫机能的下降，保持机体内氧化—抗氧化的内稳态可以提高机体的免疫能力[23]。SOD和GSH-Px的活性强弱是衡量机体清除自由基、抗氧化能力的重要指标之一。

由图6(a)可知，与阴性对照组比较，给药10，20，30 d后，低、中和高剂量组都能极显著提高小鼠血清SOD活性(P<0.01)，给药30 d高剂量组小鼠血清SOD活性提高10.46%，随给药时间的延长，SOD的活性逐渐增强，给药30 d后SOD的活性最强，且存在剂量效应关系。由图6(b)可知，与阴性对照组比较，给药10，20，30 d后，低、中和高剂量组都能极显著提高小鼠血清GSH-Px活性(P<0.01)，给药30 d高剂量组小鼠血清GSH-Px活性增加12.16%，GSH-Px活性的增加与黄酮浓度之间存在明显的剂量效应关系。藤本豆豆荚总黄酮可提高小鼠血清SOD和GSH-Px的活性，提高小鼠体内增强自由基反应的酶系统能力，降低机体内活性氧的水平，辅助增强小鼠的免疫功能，中华稻蝗也表现出相似的体内抗氧化活性[24]。

*. 与阴性对照组比较P<0.05 **. 与阴性对照组比较P<0.01

2.8 藤本豆豆荚黄酮对小鼠血清MDA浓度的影响

MDA是脂质过氧化反应的产物，其血清中浓度的高低可反映机体受氧自由基攻击的程度。是抗氧化功能评价的重要指标之一[25]。

由图7可知，与阴性对照组比较，给药10，20，30 d后，低、中和高剂量组都能极显著降低小鼠血清MDA水平(P<0.01)，给药30 d高剂量组小鼠血清随给药时间的延长，MDA浓度逐渐降低，给药30 d后MDA浓度最低(降低32.97%)，且存在剂量效应关系。藤本豆豆荚总黄酮可减轻小鼠体内活性氧引起的氧化损伤，阻断脂质过氧化反应，减少细胞损伤，杜仲叶黄酮也表现出相同的抑制氧化产物MDA积累的作用[26]。

*. 与阴性对照组比较P<0.05 **. 与阴性对照组比较P<0.01

3 结论

本试验以藤本豆豆荚为原料提取植物黄酮类化合物，利用AB-8树脂进行纯化，利用小鼠体内试验评价其免疫活性和抗氧化活性，结果表明，藤本豆豆荚总黄酮能促进正常小鼠免疫器官(胸腺系数增加12.34%、脾脏系数增加8.67%)的发育，促进小鼠脾脏淋巴细胞的增殖(增加114.68%)，增强巨噬细胞吞噬活力(提高27.16%)，诱导机体的炎症性反应(IFN-γ水平增加8.25%)，促进机体的细胞免疫，提高小鼠体内增强自由基反应的酶系统能力(SOD和GSH-Px活性分别增加10.46%和12.16%)，降低机体内活性氧的水平，减轻小鼠体内活性氧引起的氧化损伤(MDA水平降低32.97%)，阻断脂质过氧化反应，减少细胞损伤。藤本豆豆荚总黄酮具有大豆黄酮[27]、芒果皮黄酮[28]、淫羊藿黄酮[29]、白花蛇舌草黄酮[21]等植物黄酮类化合物相同的免疫调节功能，并表现出较强的体内抗氧化活性。试验可为藤本豆资源的综合开发提供理论基础，但有关藤本豆豆荚总黄酮中发挥免疫调节功能和抗氧化活性的成分鉴定及机理有待进一步研究。

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Effect of total flavonoids from perennialLablabsp. Hull on immune function in mice

CAO Bai-yingJIANGXiu-juanQIYing-xinCHANGYou-quan

(FoodEngineeringCollegeofJilinEngineeringNormalUniversity,Changchun,Jilin130052,China)

The effect of total flavonoids from PerennialLablabsp. Hull(FPLH) on the immune function and antioxidant activity in vivo were studied. With index of immune organ, spleen lymphocyte proliferation function, phagocytic activity of macrophages, cytokine levels in serum(IFN-γand IL-4), the activity of alkaline phosphatase in serum, the activity of SOD, GSH-Px and the level of MDA in serum as the evaluated indices, the immune function and antioxidant activities of FPLH in mice was studied. The results showed that the thymus index and spleen index of FPLH was higher than the control group by 12.34% and 8.67% respectively; the spleen lymphocyte proliferation activity, macrophage phagocytic activity, IFN-γ, AKP, SOD and GSH-Px levels in serum were significantly increased by 114.68%, 27.16%, 8.25%, 82.52%, 10.47%and 12.16% respectively; the MDA level in serum was significantly decreased by 32.97%. FPLH showed strong immune function and antioxidant activity in vivo.

PerennialLablabsp. ; hull; flavonoids; immune function; antioxidant activity

吉林省教育厅十二五科技规划项目(编号：2013369)

曹柏营(1979-)，男，吉林工程技术师范学院讲师，硕士。E-mail:caobaiying@163.com

2016—08—15

10.13652/j.issn.1003-5788.2017.01.036