饲养模式及光周期对中华鳖RNA/DNA比值昼夜节律的影响

冀芳烁，杨振才

(河北师范大学生命科学学院，河北石家庄 050024)



饲养模式及光周期对中华鳖RNA/DNA比值昼夜节律的影响

冀芳烁，杨振才

(河北师范大学生命科学学院，河北石家庄 050024)

为了探究光周期对中华鳖(Pelodiscussinensis)生长昼夜节律的影响及中华鳖养殖中常用的群体养殖模式(群养)与实验室研究中常用的单独养殖模式(单养)对瞬时生长的影响,实验选用RNA/DNA比值反映中华鳖的瞬时生长情况，以光周期(12 L∶12 D与24 L∶0 D)和饲养模式(单养与群养)为处理因素.实验进行15 d后，连续24 h内每隔2 h分别从各组随机取5只鳖，解剖取肌肉组织，测定其RNA/DNA比值.结果表明，中华鳖的RNA/DNA比值存在内源性昼夜节律变化，而群养模式下光周期对该节律的影响更加强烈，完全掩饰了其原本的节律；单养模式下中华鳖的RNA/DNA比值显著高于群养模式.所以在中华鳖相关研究中，单养模式能更好地反映动物内在的生理过程.

中华鳖；RNA/DNA比值；单/群养；光周期

中华鳖(Pelodiscussinensis)是古老的次生水生爬行动物，隶属于龟鳖目(Testudinata)、鳖科(Trionychidae)，在动物界占有独特的地位，具有重要的研究价值；同时中华鳖也是营养丰富的水生动物，在中国已有很大的养殖规模，已成为中国一种名特优养殖产业.中华鳖养殖模式、养殖管理技术、疾病防治和饲料的研究逐步深入，但相对于养殖产业的蓬勃发展，中华鳖的基础研究水平还很滞后.

在中华鳖养殖和资源管理的研究中，生长情况是最重要的研究指标之一.动物的生长速度多采用测定一段时间的动物体重的变化来获得,无法反映动物瞬时生长状况.近年来，许多学者开始探寻能够反映生长的瞬时生长指标.RNA/DNA比值能够反映动物体在几小时或几天内生长的变化，该比值已被证实能够用来指示动物的生长速度、营养状态以及生长潜能[1-3].RNA/DNA比值作为瞬时生长指标的应用是基于如下假设——细胞中总RNA表达量会随着蛋白合成需求的增加以及动物体的生长而相应增加，而每个细胞内DNA的含量是相对恒定的[4].大量研究已经证实水生动物的RNA/DNA比值与生长正相关[1-2,5].

昼夜节律是在动物进化过程中形成和发展的一种普遍现象，也是与环境节律变化相适应的一种反应.昼夜节律的研究在鱼类中比较多，也比较深入.很多研究已证实，鱼类的生长、运动、消化酶活性及内分泌代谢活动等都存在显著的昼夜节律[6-8].在爬行动物尤其是龟鳖类中关于昼夜节律的研究并不多，主要集中在呼吸和代谢节律的昼夜变化规律上[9].动物的生长在一天内不是匀速的，已有研究显示，鲥鱼(Alosafallaxfallax)、牡蛎(Crassostreaangulata)、蛤仔(Ruditapesdecussatus)的RNA/DNA比值存在昼夜变化[10-11].

光周期是影响动物生长代谢活动重要的环境因子之一.光周期对动物的生长、运动、摄食、个体发育及体内代谢活动均有显著影响[12-13].在调控动物昼夜节律的环境因子中，光周期是最重要的[14-15]，然而其对动物生长及生理功能的抑制或促进作用存在物种差异[16-17].光周期对中华鳖RNA/DNA比值昼夜节律变化存在怎样的影响鲜有报道.社群行为(social behaviour)泛指种群中2个或更多个体间的相互作用[18].龟鳖类动物会为了食物、筑巢地、晒背场所而竞争，会产生如撕咬、推拱等攻击行为，以此在个体间建立获取资源的等级制度[19-21].在中华鳖养殖中多采用大塘群体养殖模式(群养)，而实验室研究中则多采用单独养殖模式(单养)，这种不一致使得实验室研究结果在实际养殖中的应用受到了一定的限制.目前关于单养和群养研究报道的并不多，大多关注的是其造成传统生长指标的差异[22-23].

本实验选择瞬时生长指标RNA/DNA比值探究中华鳖生长的昼夜节律，同时探究光周期以及2种饲养模式——单养与群养对该节律的影响，有助于完善中华鳖生长机制的理论，为水产精确养殖提供理论指导.

1 材料与方法

1.1 实验设计

分别以光周期(12 L与24 L)和饲养模式(单养与群养)为处理因素，实验共分为4个处理组，IA(单养，24 L)，ID(单养，12 L)，GA(群养，24 L)，GD(群养，12 L).单养处理采用每桶1只实验动物的饲养模式，群养处理采用每桶5只实验动物的饲养模式.12 L处理采用12 L∶12 D的光周期，定时开关设定6∶00—18∶00给予光照，24 L处理采用每日24 h连续光照.

1.2 实验动物和实验条件

实验用稚鳖从河北石家庄中华鳖养殖场购得，生长实验在河北师范大学鱼类养殖实验室进行.养殖桶直径60 cm，高71 cm，材质为遮光玻璃钢，桶内总水体积30 L，水深15 cm.水面光强为150 lx.桶内设有恒温器，水温保持在(30±0.1)℃；pH保持在7.5～8.0.养殖用水采用自来水，经生石灰(70 mg/L)消毒、曝气、调温后使用，每日换水量为桶内总水体积的1/6.实验所用饲料由河北海泰科技有限公司生产，将其加工为直径2 mm软颗粒饲料.

1.3 实验过程

对实验动物进行为期7 d的驯化，使其适应实验室的养殖环境.驯化时光周期统一为12 L∶12 D(6∶00～18∶00给予光照).实验动物每日饱食投喂2次，投喂时间为8∶30和20∶30，每次投喂30 min后用虹吸管将残饵及粪便吸出.

驯化结束后，260只中华鳖(平均体重±标准差为(27.73±9.37)g)随机分入4个处理组，每个处理组65只鳖，进入正式实验期，除IA和GA 2个处理组的光周期变为24 h全光照外，其余养殖条件与驯化期保持一致，正式实验首先进行10 d.然后，所有实验动物开始进行饥饿处理，其余实验条件均不改变，禁食5 d以消除摄食对RNA/DNA比值的影响.

禁食期结束后，从10点开始，连续24 h内每隔2 h分别从各组随机取5只鳖，使用MS-222进行麻醉处理.解剖取其前肢肌肉组织(剔除脂肪团)，用7 g/L冰生理盐水冲洗干净，并用滤纸吸干后装入冻存管中，立即液氮冷冻，并转移到-70 ℃冰箱保存待测.

1.4 RNA/DNA比值的测定

RNA/DNA比值的测定方法参考Xu等[24]的操作步骤略作修改.切取10～15 mg冰冻的组织，使用RNA提取试剂盒(GK3016,上海杰瑞生物工程有限公司)和DNA提取试剂盒(GK0122,上海杰瑞生物工程有限公司)分别将RNA和DNA从每份组织中提取出来，最后通过测定样品在260 nm处的吸光值换算出核酸含量，以(ng/mg组织湿重)作为单位.每份组织的RNA和DNA分别独立提取，各做3个重复,最终得到的RNA和DNA样品在测定其浓度前，先进行纯度检测，即测定其OD260/OD230，该比值的正常范围是1.8～2.0，不在正常范围的样品认为测定过程中核酸受到污染或者降解，测定值不予使用，重新切取组织测定.

1.5 数据分析

所有分析均使用统计软件STATISTICA(version 10.0)进行.使用3因素方差分析来探究取样时间、光周期和饲养模式对中华鳖RNA/DNA比值的影响.P< 0.05认为达到统计学显著差异.

2 结果与分析

3因素方差分析显示，饲养模式存在显著差异，单养模式下的RNA/DNA比值显著高于群养模式(F1,208=155.082,P=0)，进一步分析发现IA处理组的RNA/DNA比值的平均水平比GA处理组高35.84%，ID处理组的RNA/DNA比值的平均水平比GD处理组高61.39%；取样时间与饲养模式之间交互作用显著(F12,208=2.347,P=0.008)；光周期与饲养模式之间交互作用显著(F1,208=7.109,P=0.008).

3 讨论

本实验中4个处理条件下，中华鳖RNA/DNA比值均表现出了显著的昼夜变化.与本实验结果类似的鲥鱼、牡蛎、蛤仔的RNA/DNA比值同样存在昼夜变化[10-11].本实验的单养模式下，全光处理组与12 L∶12 D光周期处理组RNA/DNA比值的昼夜变化模式基本相似，均是在10∶00和22∶00出现峰值.差异仅表现在次日6∶00，全光处理组的RNA/DNA比值处在较高水平的峰值，而12 L∶12 D光周期处理组的RNA/DNA比值却处于较低的谷值(图1).Pittendrigh[25]提出，若节律在恒定条件下仍存在，即认为该节律是由内部生物钟控制的内源性节律.所以本实验中RNA/DNA比值在光照持续存在的恒定条件下，仍存在与12 L∶12 D光周期下同样的节律模式，笔者认为中华鳖RNA/DNA比值存在内源性节律变化.红耳龟(Trachemysscriptaelegans)的呼吸及代谢活动同样被证实存在内源性昼夜节律变化[9].此外，猜测中华鳖RNA/DNA比值的内源昼夜节律在6∶00也存在峰值，就如全光处理下所表现的，但是实验中12 L∶12 D光周期处理组的开灯时间正是早上6∶00，突然给予的光照刺激可能对中华鳖RNA/DNA比值的内源昼夜节律产生了影响，导致2个光周期下中华鳖RNA/DNA比值在6∶00表现出较大的差异.很多文献已证实光作为一个重要的环境刺激因子，能够改变生物节律，突然给予的光照同样会使红耳龟的呼吸和代谢节律产生明显的变化[9].而群养模式下，2个光周期RNA/DNA比值的昼夜变化模式却大不相同(图2).全光处理条件下中华鳖RNA/DNA比值的内源昼夜节律模式基本仍存在，3个高峰出现在12∶00,次日0∶00及6∶00.而12 L∶12 D光周期处理组的RNA/DNA比值昼夜节律却完全不同，仅有2个峰值分别出现在20∶00和次日4∶00.笔者认为是群养模式中动物的社群行为与光周期共同作用最终对动物生理过程产生了影响，群养条件下，光周期对节律的影响更加强烈，几乎完全掩饰了其原本的节律.已有研究证实动物内源性节律的表达是不稳定的，会受到外界刺激因子的修饰而使节律发生比较大的变化[26].然而有研究认为光周期对中华鳖摄食量、生长、能量转换均无显著影响，可能是由于该实验鳖体重范围较大(12～71.2 g)，体重的影响掩盖了光周期的影响[27].综上，笔者认为在中华鳖相关研究中，饲养模式的差别可能会带来不容忽视的影响，单养模式更能反映动物内在的一些生理过程.

图1 单养模式中华鳖RNA/DNA比值在不同光 周期下的昼夜变化(n=5)

图2 群养模式中华鳖RNA/DNA比值在不同光 周期下的昼夜变化(n=5)

本实验的结果显示，2个光周期条件下，中华鳖RNA/DNA比值均表现出在单养模式下显著高于群养模式，这可能是由群体饲养环境下中华鳖之间的社群行为导致的.13周的幼年咸水鳄就已表现出排斥同类的行为，领域性很早就形成了，研究认为攻击行为可能是造成人工饲养中不同生长速度的主要原因[28].一些使用传统生长指标的研究结果与本实验结果相似，群养的中华鳖养殖35 d后特定生长率显著低于单养的中华鳖[22].0～3周黑羽鹌鹑在生长后期，随着雏鹑身体发育逐渐完善，体温调节能力相对稳定，群养个体间开始出现抢食、打斗行为，而单养无争斗行为，从而导致后期单养组体重显著大于群养组.同时单养组的产蛋量也高于群养组[23]，说明种内攻击行为会抑制动物的生长.研究证实群养的中华鳖较单养组的非特异性免疫应答有所加强[22]，说明群养模式下中华鳖可能处于应激状态.所以，本实验中群养组的中华鳖可能也是由于存在种内攻击行为而处于竞争的应激状态，从而导致了RNA/DNA比值较低，生长受到了抑制.另外，本实验中2种饲养模式养殖密度的差异同样可能导致了中华鳖RNA/DNA比值的显著差异.在水产养殖中，高密度是最常见的压力因素之一，在拥挤胁迫压力状态下，动物的活动加强，用于生长的能量被转化为运动能，并且导致多种生理性应答，如食欲下降，食物利用率下降，生长下降等[22,29-32].对于养殖密度有2种描述方法，biomass/m2和individual/m2.在短时间内，体重改变微弱，所以对生理特征的影响主要是动物数量[22].研究发现高密度组6只/缸(18.75 只/m2)的中华鳖活动加强，特定生长率下降[22].与此相似，本实验中群养模式的养殖密度达到了5 只/缸(17.69 只/m2)，说明中华鳖可能存在拥挤压力胁迫.所以，本实验中群养组的中华鳖同样可能由于代谢能较多地转移为运动能，从而导致了RNA/DNA比值较低，生长受到了抑制.

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(责任编辑：赵藏赏)

Impacts of rearing mode and photoperiod on the daily rhythms of RNA/DNA ratio inPelodiscussinensis

JI Fangshuo,YANG Zhencai

(College of Life Science,Hebei Normal University,Shijiazhuang 050024,China)

In this study,the impact of photoperiod on daily growth rhythm and the impact of rearing mode on instantaneous growth ofPelodiscussinensiswere investigated.Turtles are grouply housed in fishery while they are separately housed in laboratory experiments.In this experiment,RNA/DNA ratio was chose to reflect the instantaneous growth inP.sinensis.Two photoperiod regimes—12 h light with 12 h dark (12 L∶12 D) and 24 h light with 0 h dark (24 L∶0 D) accompanied with two rearing modes—individual (I) and group (G) were used as treatment factors.Turtles were housed under specific experimental conditions for 15 days,after then five turtles were randomly sampled from each group every 2 h for 24 h.Muscle tissues were dissected for the measurement of RNA/DNA ratio.The results showed that there exists endogenous circadian rhythm of RNA/DNA ratio inP.sinensis.While the rhythm in turtles grouply housed was strongly influenced by photoperiod,the endogenous rhythm was totally masked.And the ratio in separately housed turtles was significantly higher than that in grouply housed turtles.In conclusion,the individually rearing mode can better reflect the intrinsic physiological process inP.sinensis.

Pelodiscussinensis; RNA/DNA ratio; individually/grouply housed; photoperiod

10.3969/j.issn.1000-1565.2017.01.009

2016-04-15

国家自然科学基金资助项目(31172085)；河北省研究生创新项目(sj2015006)

冀芳烁(1988—)，女，河北平山人，河北师范大学在读博士研究生,主要从事水生动物学方面的研究. E-mail:jifangshuo@163.com

杨振才(1962—)，男，河北行唐人，河北师范大学教授，主要从事水生动物学方面的研究.E-mail:zcyang@hebtu.edu.cn

Q95

A

1000-1565(2017)01-0056-06