鲢鱼复合酶解产物的理化及功能特性研究

周 航,何 强

(四川大学轻纺与食品学院,四川成都 610065)

鲢鱼复合酶解产物的理化及功能特性研究

周 航,何 强*

(四川大学轻纺与食品学院,四川成都 610065)

采用复合蛋白酶及风味蛋白酶对鲢鱼鱼肉进行复合酶解,通过控制水解时间制得产品SCH1、SCH2、SCH3、SCH4和SCH5,其水解度分别为7.5%、9.4%、10.3%、11.6%、14.6%,考察其分子量、等电点等基本特性,并与酶解前对比考察其持油性、溶解性、起泡性、乳化性等功能性质,同时对其体外抗氧化活性进行研究。结果表明:五种酶解产物的等电点均为pH2左右,重均分子量分布于1000～3000 u之间;与酶解前相比,产品溶解性提高57.99%以上,持油性略有降低;乳化性、起泡性均明显增强,酸性环境(pH2)中起泡性最差,而碱性环境(pH10)中乳化性最强;ABTS+·清除率、脂质过氧化抑制率及还原能力均随水解度增大而升高,其中清除率最高达到90.75%。所研发鲢鱼酶解产品既可直接食用,又能作为原辅料应用于食品加工过程,可为鲢鱼精深加工产品研发提供新思路。

鲢鱼,复合酶解,分子量,等电点,功能性质,抗氧化活性

在我国,鲢鱼属大宗淡水养殖鱼类,分布广泛,生长速度快且个体大,鱼体营养丰富,水分含量高,目前多以鲜销的方式进入市场。但源于其肉薄、刺多、腥味重等缺点,市面销售价格很低,且鲢鱼体内的组织酶等活跃,造成滞销的鲢鱼易腐败变质,导致大量鲢鱼资源的浪费[1]。目前,以鲢鱼为原料的加工产品主要有冷冻鱼片、鱼糜制品、腌制或干制品、鱼排等,对于鲢鱼蛋白的利用较少[2]。鲢鱼蛋白属优质蛋白,必需氨基酸种类齐全且含量丰富,若充分利用,必能开发出兼具经济及营养价值的高值蛋白制品。因此,开发鲢鱼蛋白精深加工产品,提高鲢鱼利用率及其附加价值,避免资源浪费是淡水鱼行业亟待解决的重要问题。

郭浩楠[3]等研究了碱性蛋白酶对鲢鱼蛋白的酶解效果,发现酶解产物的功能性质均有一定提高;陈志军[4]等采用复合蛋白酶对鲢鱼蛋白进行水解改性,发现酶法水解对鲢鱼蛋白质的部分功能性质有一定改善;杨远帆[5]等研究了碱性蛋白酶和复合蛋白酶分段水解鲢鱼蛋白的工艺,并以氨基酸态氮含量为指标确定了高产率水解工艺。本研究基于以上研究,采用风味蛋白酶和复合蛋白酶对鲢鱼鱼肉进行复合酶解,制得不同水解度的酶解产物,并考察其理化性质、功能性质及体外抗氧化活性,以期为鲢鱼蛋白的进一步开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

鲢鱼 购于成都市武侯区郭家桥菜市场;风味蛋白酶(Flavourzyme,28.5×104U/g)、复合蛋白酶(Protamex,10.7×104U/g) Novo酶制剂公司;DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)、ABTS(2,2′-联氨-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸) 美国Sigma公司;其他试剂 均为分析纯。

TG-1850台式多功能离心机 四川蜀科仪器有限公司;TU-1901双光束紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司;Nano S90纳米粒度及Zeta电位分析仪 英国Malvern公司。

1.2 实验方法

1.2.1 酶解工艺 新鲜鲢鱼300 g,除去鱼鳞、头尾、内脏,经粉碎机绞碎后得鱼肉150 g,加入150 g蒸馏水调成鱼浆,105 ℃下蒸煮脱脂10 min,纱布过滤冲洗沥干得鱼肉泥。取鱼泥100 g加入267 mL蒸馏水,混匀后在53 ℃、pH7.3条件下进行酶解,加酶量为风味蛋白酶(0.24±0.005) g、复合蛋白酶(0.60±0.005) g,分别酶解15、30、50、80、120 min后,95 ℃下灭酶20 min,酶解液过滤后取样测定水解度,冷冻干燥(干燥时间48 h,干燥温度20～35 ℃)制得蛋白粉产品SCH1、SCH2、SCH3、SCH4、SCH5。以鲢鱼未经水解所得产品为空白样品(CK)。

1.2.2 指标测定

1.2.2.1 水解度 水解度测定采用pH-STAT法[6]。

1.2.2.2 等电点 等电点测定参考程海明[7]等的方法,其中样品溶液浓度为1 mg/mL。

1.2.2.3 分子量 重均分子量测定采用Viscoteck 270 maxTM凝胶渗透色谱(GPC)和TSK gel G2000SWXL凝胶色谱柱构成的凝胶渗透色谱系统进行检测。用pH7.0,0.1 mol/L的磷酸盐缓冲液配制10 mg/mL的样品溶液,检测条件:进样量100 μL,柱温30 ℃,样品溶剂为洗脱液,流速0.6 mL/min。

1.2.2.4 持油性 持油性(oil holding capacity,OHC)以每克样品吸附油的质量表示。准确称取0.200 g样品(精确到0.001 g)与5 mL大豆油于离心管(质量记为m0)中混匀,室温下静置30 min,8000 r/min离心30 min,弃去上清液,称量样品和离心管重量(m1),质量增加量即为样品吸油量,计算方法如式(1):

式(1)

1.2.2.5 溶解性 溶解性测定采用氮溶解指数(NSI)[8]法改进,分别配制0.5 mg/mL样品溶液,调节溶液pH分别为2、4、6、8、10、12,10000 r/min离心15 min,采用考马斯亮兰法测定上清液蛋白质含量,同时测定对照中蛋白质含量,溶解性计算方法如式(2):

式(2)

1.2.2.6 起泡性、泡沫稳定性[4,9]准确称取0.5 g样品溶于50 mL去离子水中,分别调pH为2、6、10,10000 r/min分散1 min后转移至量筒中,量取起始泡沫体积,记录均质停止后10、30、60、90 min时的泡沫体积,以此测定样品泡沫稳定性,起泡性及泡沫稳定性，计算方法见式(3)、式(4)。

式(3)

泡沫稳定性(%)=一段时间后的泡沫体积(mL)/初始泡沫体积(mL)×100

式(4)

1.2.2.7 乳化性[4,9]准确配制0.2%(质量分数)的样品溶液,分别取30 mL调溶液pH至2、6、10,加入10 mL大豆油后10000 r/min分散1 min,立即用移液枪于容器底部取样50 μL,加入0.1%(质量分数)SDS溶液10 mL,混匀后在500 nm处测定其吸光度,以SDS溶液做空白对照,乳化性计算方法如式(5)。

式(5)

式中:n为稀释倍数;A为乳化液吸光度;c为样品质量浓度(g/mL);φ为乳化液中油相比例,为0.25。

1.2.2.8 抗氧化能力 ABTS+·阳离子清除能力、还原能力、脂质过氧化抑制能力测定均参考曾维才[10]的方法。

脂质过氧化抑制能力测定对曾维才[10]的方法进行改进。测定时采用鸡蛋黄匀浆(10%,v/v)作为反应的脂质媒介。取0.1 mL受试物溶液(5 mg/mL,w/v)与0.5 mL蛋黄匀浆液、0.4 mL蒸馏水及50 μL硫酸亚铁溶液(70 mmol/L)混合,充分摇匀,37 ℃下孵育30 min,迅速加入1.5 mL乙酸溶液(20%,v/v)、1.5 mL硫代巴比妥酸溶液(0.8%,w/v,用1.1% SDS溶液配制),充分振荡后95 ℃水浴反应60 min。待反应物冷却至室温,加入5 mL正丁醇,摇匀后10000 r/min离心20 min,取上清液在532 nm下测定吸光度,以不添加脂质媒介(10%鸡蛋黄匀浆,v/v)的样品溶液(5 mg/mL,w/v)作对照,以排除样品自身含有的不饱和脂肪酸的干扰,蒸馏水做空白对照。计算方法如式(6)。

脂质过氧化抑制率(%)

式(6)

1.3 数据处理

实验数据用平均值±标准差表示,n=3。

2 结果与分析

2.1 鲢鱼酶解产物的基本特性

预实验阶段分别考察了碱性蛋白酶、复合蛋白酶、风味蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶对鲢鱼鱼肉的水解作用,通过对水解过程及产物性质的分析,最终选择水解程度高的复合蛋白酶及产物风味佳的风味蛋白酶对鲢鱼鱼肉进行复合水解,酶解时间(180 min)内产物水解度保持增长趋势,表明该时间内水解反应处于酶量充足的状态。通过控制水解时间,制得水解度在7.5%～14.6%之间的五种酶解产物,其等电点及重均分子量见表1所示。

表1 鲢鱼酶解产物的基本特性Table 1 Basic characteristics of silver carp hydrolysates

采用纳米粒度及Zeta电位分析仪对产品进行等电点测定,样品在低pH时带正电荷,高pH时带负电荷,处于等电点时正负电荷相等,表面电势为零[11]。五种酶解产物的等电点均在pH2左右(见表1),其中酶解产物SCH5的等电点(pI)为1.9(见图1)。鲢鱼蛋白中酸性氨基酸含量高于碱性氨基酸,水解作用将其肽链打断,断裂的肽键增多,使得蛋白质表面的电荷分布发生变化,且暴露出的酸性氨基酸数目增加,从而导致样品等电点均偏酸性。

图1 鲢鱼酶解产物SCH5的等电点Fig.1 Isoelectric point of silver carp hydrolysate SCH5

经过蛋白酶的水解作用,鲢鱼蛋白大分子聚合物逐步解体,产生分子量较小的多肽和游离氨基酸。随水解程度的增大,样品分子量逐渐减小,均处于1000～3000 u之间(见表1),表明酶解过程产生大量肽段及氨基酸,极大的改变了鲢鱼蛋白的结构,从而导致产物功能性质及生物活性的变化。小分子肽的增加有利于溶解性的改善,同时产生具有一定功能性的肽段[12],不仅改变了鲢鱼蛋白原有形态从而提高其实用价值,而且增加产品功能性拓宽其应用范围,为鲢鱼蛋白的精深加工奠定了理论基础。

2.2 溶解性及持油性

蛋白质的溶解性与分子大小密切相关,而持油性则源于蛋白微粒对油脂的物理截持作用。水解作用造成蛋白质肽链断裂,一、二级结构被破坏,聚合体逐步解体,分子量降低,暴露在外的极性基团(-COOH、-NH2-等)数目增加,疏水基团相对减少[4,13]。由表2可知,酶解样品的溶解性有极大改善,与酶解前相比增加57.99%以上,且与水解度呈正相关;持油性则略有下降,与水解度呈负相关,其中SCH1表现出较优的持油性能。水解作用破坏了鲢鱼蛋白的网络结构,随水解度增加,肽链舒展,蛋白质微粒越大,总表面积越小,其宏观上表现为样品的容积密度越大,持油能力越小[3]。然而SCH1表现出的良好持油性,应源于轻度水解条件下鲢鱼蛋白的部分空间结构被破坏,肽链舒展且断裂较少,因此对油脂的截留作用较优。同时,水解作用使得极性基团增加,亲水性提高,从而促使蛋白质与水的相互作用增强,致其溶解性增加,且随水解度的增大(DH7.5%～14.6%),酶解体系中暴露的亲水基团增加,溶解性随之增大。

溶解性能影响蛋白质的多种功能性质,包括增稠、起泡、乳化和凝胶作用等,不溶性蛋白在食品中的应用非常有限[14]。经过水解作用,鲢鱼蛋白的溶解性大大提高,从而拓宽其应用范围,既可作为半成品应用于食品加工中,又能作为高营养价值的蛋白粉直接冲调食用。

表2 鲢鱼酶解产物的溶解性和持油性Table 2 Solubility and oil holding capacity of silver carp hydrolysate

2.3 起泡性及乳化性

蛋白质同时具有亲水亲油基团及区域,是一种两性高聚物,能自发的迁移至汽-水界面或油-水界面,因此具有较优的表面活性,起泡性和乳化性则是两种基于良好溶解性下的重要界面性质。本实验分别探讨了pH2、pH6、pH10环境中鲢鱼酶解前后的起泡(图2A)及乳化性能(图2B)。结果表明,在不同酸碱环境中五种酶解产物的起泡性及乳化性高于酶解前(酸性条件下SCH1起泡性略低于酶解前),且在酸性环境(pH2)中起泡性最差,而碱性环境(pH10)中乳化性最强。在酸性环境中SCH2～SCH5起泡性提升15%以上；在中性及碱性条件下，酶解样品起泡性提升20%以上。

图2 鲢鱼酶解产物的起泡性(A)与乳化性(B)Fig.2 Foaming ability(A)and emulsifying activity index(B)of silver carp hydrolysates

起泡性及乳化性受蛋白质溶解性的影响极大,基于鲢鱼蛋白的不溶性,其起泡能力及乳化性能明显较差。又由于水解作用将大分子的蛋白质肽链逐步断开,形成小分子的肽,溶解性提高,蛋白质能迅速分散至汽-水界面,从而形成粘稠的薄膜[15-16];同时暴露出更多的疏水基团,使蛋白质更易于在油/水界面上扩散并定位,因此乳化能力增强[17-18]。由表1可知,五种酶解产物等电点均分布在pH2左右,此时分子表面净电荷量降至最小值,水合作用减弱导致蛋白质分子的聚集和沉降,溶解性变差,导致起泡性变差。酸性环境下SCH1的起泡性略低于酶解前,推测是由于水解程度低,促使部分肽链展开,在汽-水界面形成薄膜的能力较差。此外,不同酶解产物在碱性环境(pH10)中表现出的良好乳化性能源于蛋白酶的轻度水解作用使其在该环境下带有大量负电荷,增加了液滴的静电相互作用,使液滴之间产生排斥力,从而阻止液滴凝聚[19-20]。

通常来说,具有良好起泡性的蛋白质不具有稳定泡沫的能力,而产生稳定泡沫的蛋白质往往显示不良的起泡性[13]。由图3～图5可知,CK在pH2、pH6、pH10环境中产生的泡沫比例于10 min时仍维持在100%、94.29%及100%,表现出良好的泡沫稳定性。与之相反,10 min时酶解产物的泡沫仅在pH2环境中表现出较好的稳定性,SCH1的泡沫比例为100%,而pH6和pH10中SCH1的泡沫比例仅为10.91%和53.19%,该现象源于蛋白质在等电点缺乏界面及吸附分子的推斥相互作用,导致吸附至界面的蛋白质数量增加,泡沫稳定性良好[21]。酶解产物具有的良好起泡性及乳化性极大的提高其实用价值,起泡/乳化能力高、适用性强、具有营养价值的产品正是食品工业需求量极大的理想的起泡剂/乳化剂。

图3 pH=2时鲢鱼酶解产物的泡沫稳定性Fig.3 Foaming stability of silver carp hydrolysates(pH=2)

图4 pH=6时鲢鱼酶解产物的泡沫稳定性Fig.4 Foaming stability of silver carp hydrolysates(pH=6)

图5 pH=10时鲢鱼酶解产物的泡沫稳定性Fig.5 Foaming stability of silver carp hydrolysates(pH=10)

2.4 ABTS+·清除及脂质氧化抑制能力

预实验中对比考察了酶解产物对ABTS+·及DPPH自由基的清除效果,结果表明清除ABTS+·的效果更优,因此本实验仅探讨样品对ABTS+·的清除能力,以及抑制脂质过氧化的效果。如图6所示,随样品水解度增大,ABTS+·清除率及脂质过氧化抑制率不断增加,SCH5(DH14.6%)的清除率和抑制率分别为90.75%、40.54%。

图6 鲢鱼酶解产物的ABTS+·清除能力及脂质氧化抑制能力Fig.6 ABTS+· scavenging capability and lipid peroxidation inhibition of silver carp hydrolysates

鲢鱼蛋白在水解过程中暴露出部分活性氨基酸基团,生成具有较强供给氢能力的产物,易与ABTS+·阳离子中的活性电子结合。随水解度增加,酶解产物中的游离氢离子数量增多,猝灭自由基氧化活性的能力增强,从而降低体系的氧化态势,体现出较强的抗氧化活性。同时,脂质过氧化属自由基链式反应,该过程既需要自由基的启动,也产生大量的自由基,反应过程还依靠自由基的推动作用。酶解产物对其的抑制作用应源于抗氧化肽及活性氨基酸对自由基的猝灭和链式反应的阻断效应的双重作用[10]。

生物体内过量的自由基会攻击蛋白质、脂质、核酸等生物大分子,破坏细胞及组织器官,而酶解产物表现出的较强抗氧化性增加了产品的功能性,进一步拓宽了产品的应用范围。

2.5 还原能力

实验中以物质对三价铁离子的还原作用强弱测定其还原能力,反应产物在700 nm处有特征吸收峰,其生成量与受试物的还原能力呈正相关,因此以产物吸光度值变化表征样品还原能力强弱,如图7所示。结果表明,随酶解产物水解度增加,吸光度值逐渐增大。水解过程中暴露的抗氧化肽及抗氧化氨基酸增多,体系中被还原的Fe3+数量增加,表明其还原能力逐渐增大。

图7 鲢鱼酶解产物的还原能力Fig.7 The reaction on reducing capability of silver carp hydrolysates

3 结论

本文以鲢鱼为原料,采用复合蛋白酶和风味蛋白酶进行复合酶解,通过控制水解时间制得水解度在7.5%～14.6%之间的五种酶解产物,其等电点均在pH2左右,重均分子量为1000～3000 u之间。与酶解前相比,产品溶解性增加57.99%以上,SCH1持油性较酶解前提升了(0.86±0.11)g/g样品,但SCH2～SCH5持油性均低于酶解前;在中性及碱性条件下,样品起泡性提升20%以上,酸性环境中SCH2～SCH5提升15%以上;碱性环境中样品具备优良乳化性(乳化性60%以上)。同时,随水解程度增加(7.5%～14.6%),样品表现出递增的ABTS+·清除能力、脂质氧化抑制能力及还原能力。经过蛋白酶水解作用,本产品改变了鲢鱼的食用方式,增加了食品种类,不仅可作为食品直接食用,亦可作为半成品用于食品加工过程,拓宽了鲢鱼蛋白制品的应用范围。本产品兼具功能性及抗氧化性,是鲢鱼精深加工产品的新突破,极大的提高了其经济附加值,拓宽其应用前景。

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Physicochemical and functional properties of the enzymatic hydrolysates of silver carp

ZHOU Hang,HE Qiang*

(Sichuan University,College of Light Industry and Food Engineering,Chengdu 610065,China)

Using flavourzyme and protamex combined-enzyme method,the silver carp hydrolysates named SCH1,SCH2,SCH3,SCH4 and SCH5 were obtained by controlling the hydrolysis time,whose degree of hydrolysis were 7.5%,9.4%,10.3%,11.6% and 14.6%,and the molecular weight,isoelectric point,oil holding capacity,solubility,emulsifying activity,foaming capacity and antioxidant activity of silver carp hydrolysates were investigated in this paper. The results showed that isoelectric point of hydrolysates was about pH2,and the Mwwas between 1000～3000 u.After enzymatic hydrolysis,solubility of products increased by 57.99 percent,but oil holding capacity decreased. Meanwhile,emulsifying and foaming properties were significantly enhanced,and foaming was the worst in acidic environment(pH2)while the emulsifying was the best in alkaline environment(pH10).The ABTS+·-scavenging capability,lipid peroxidation inhibition and reducing capability were obviously increased as the increased degree of hydrolysis(DH7.5%～14.6%),in which the ABTS+·-scavenging rate reached 90.75%. The products are both functional and antioxidative,which can be eaten directly,and can also be used as raw materials in food processing. Results may provide new idea for the development of some deep processing products of silver carp.

silvercarp;combined-enzymemethod;molecular weight;isoelectric point;functional properties;antioxidant activity

2016-08-16

周航(1992-)，女，硕士研究生，研究方向：食品工程，E-mail：zhouhang0602@foxmail.com。

*通讯作者:何强(1971-)，男，博士，教授，研究方向：农产品加工及质量安全，E-mail：heq361@163.com。

TS254.1

A

:1002-0306(2017)04-0158-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.04.022