不同溶剂提取葡萄酒中白藜芦醇及其糖苷异构体

王 宓,赵 然,刘 琳,任晓宇,锁 然

(河北农业大学食品科技学院,河北保定 071001)

不同溶剂提取葡萄酒中白藜芦醇及其糖苷异构体

王 宓,赵 然,刘 琳,任晓宇,锁 然

(河北农业大学食品科技学院,河北保定 071001)

利用白藜芦醇及其糖苷异构体几乎不溶于水,易溶于有机溶剂的性质,比较了乙酸乙酯、氯仿、乙醚,乙酸乙酯与正己烷、二氯甲烷混合溶液及双水相体系对葡萄酒中白藜芦醇及其糖苷异构体的提取效果,得到了最佳的提取溶剂。结果表明:乙酸乙酯对目标化合物的提取效果优于其他有机溶剂,对白藜芦醇苷的提取率可达90%以上,对白藜芦醇的提取率低于80%。乙酸乙酯萃取操作简单、提取率较高,切实可行。

白藜芦醇,白藜芦醇苷,提取,双水相体系

白藜芦醇是多酚类化合物,主要来源于花生、葡萄(红葡萄酒)、虎杖、桑椹等植物[1]。白藜芦醇是一种生物性很强的天然多酚类物质,又称为芪三酚,化学名为3,4′,5-三羟基芪,有顺式和反式两种类型,是肿瘤的化学预防剂,也是降低血小板聚集,预防和治疗动脉粥样硬化、心脑血管疾病的化学预防剂[2-3]。目前国际上对白藜芦醇的研究开发十分广泛,富含白藜芦醇的保健品、药品和酒类的相关产品很多,白藜芦醇的生物活性[4-5]在全球范围内已经得到基本的认可。天然植物中的白藜芦醇含量极低,一般不会高于0.5%,且反式白藜芦醇比顺式白藜芦醇在稳定性上和生理活性上都要更好[6-7],因此研究白藜芦醇的提取工艺具有着重要的意义。

目前,白藜芦醇的检测还没有一个完整的标准,对白藜芦醇的提取方法也各式各样[8],张建超[9]等人用加热回流法研究了虎杖中白藜芦醇苷的提取分离工艺,其中水提工艺的最优条件为:10倍水量,回流提取三次,2 h/次;曾静亚[10]等人研究了快速溶剂萃取提取白藜芦醇和白藜芦醇苷工艺的响应面优化,分析出最佳组合条件为:乙醇浓度51%,提取温度96 ℃、提取时间16 min。

本文采取了溶剂提取法,比较了几种不同有机溶剂和新型双水相体系对葡萄酒中白藜芦醇及其糖苷异构体的提取效果,对提高白藜芦醇及其糖苷异构体的提取率提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

反式-白藜芦醇苷纯品(>98%)、反式-白藜芦醇纯品(>98%) 冠宇生物科技有限公司;甲醇、正己烷、硫酸铵、无水乙醇、正丙醇 分析纯,天津市科密欧化学试剂有限公司;乙酸乙酯、乙醚、二氯甲烷、氯仿、氯化钠 分析纯,天津市进丰化工有限公司;碳酸钠 分析纯,天津市福晨化学试剂厂;磷酸氢二钾 分析纯,天津市光复科技发展有限公司;乙腈 色谱纯,进口Burdick & Jackson高纯试剂;葡萄酒 当地超市购买。

高效液相色谱仪,配2998DAD检测器 美国Waters公司;色谱柱 BDS HYPERSIL C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);电子分析天平 美国sartorius公司;溶剂过滤器(1000 mL) 天津津藤实验设备有限公司;SH2-111真空泵 上海知信实验仪器技术有限公司;PHS-3C型pH计 奥豪斯仪器有限公司;旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 白藜芦醇类化合物提取方法 用移液管取10 mL酒样(加一定量的顺式、反式-白藜芦醇及顺式、反式-白藜芦醇苷标准混合液)于锥形瓶中,分别加入10 mL乙酸乙酯、氯仿、乙醚、乙酸乙酯∶正己烷(50∶50、10∶90、90∶10)和乙酸乙酯∶二氯甲烷(50∶50、10∶90、90∶10),超声提取25 min,功率90 Hz混匀[11-12],静置20 min,用分液漏斗分层,取上层液后分别加入上述有机溶剂10 mL,重复一次,氮气吹干,2 mL甲醇回溶,过有机膜,进液相分析,重复3次取平均值。

1.2.2 乙酸乙酯萃取方法 取两份15 mL葡萄酒样品于分液漏斗中,其中一份加2.0 g氯化钠溶解,均加入20 mL的乙酸乙酯充分振荡,静置分层,分离出有机相过无水硫酸钠,重复一次,50 ℃水浴真空蒸发至近干,加2.0 mL无水乙醇回溶,过有机膜,进液相分析,测定不同有机溶剂对目标化合物的提取率,比较在葡萄酒中加氯化钠和不加氯化钠的提取结果,计算两种条件下对目标化合物的提取率。通过峰面积比较两种方法对葡萄酒中顺,反白藜芦醇及其糖苷异构体的提取结果,重复3次取平均值。

1.2.3 双水相体系的选择 取30 mL的水溶液于锥形瓶中,分别加入15 g氯化钠、碳酸钠、硫酸铵、磷酸氢二钾,均分为三等份,分别加入10 mL甲醇、乙醇和正丙醇,振荡混合,静置,上层为有机相,下层为水相,重复3次取平均值。

分相效果由R=V上/(V上+V下)判定,当R的值和R0=V上0/(V上0+V下0)的值越接近时,其分相效果越好。其中V上0和V下0分别为分相前有机溶剂的体积和蒸馏水的体积,V上和V下分别为分相后上下相的体积。

1.2.4 乙酸乙酯和双水相萃取结果对比

1.2.4.1 乙酸乙酯萃取 用移液管取10 mL酒样(加一定量的顺,反白藜芦醇及苷标准混合液)于锥形瓶中,加2.0 g氯化钠使其溶解,加10 mL乙酸乙酯,超声提取25 min,静置分层,取有机层。重复一次,旋蒸蒸干,2 mol甲醇和4 mol水回溶,过有机膜,进液相分析,重复3次取平均值。

1.2.4.2 双水相体系萃取 取20 mL水,加7.0 g(NH4)2SO4振荡溶解,加20 mL无水乙醇,使之分层,制成双水相体系[13]。取10 mL酒样,加20 mL双水相体系,超声提取25 min混匀,静置,收集有机层。重复一次,合并上层液,旋转蒸发至近干,用2 mL甲醇和4 mL水回溶,过有机膜,进HPLC分析,重复3次取平均值。

用乙酸乙酯和双水相体系萃取葡萄酒中的白藜芦醇及其糖苷异构体,比较两种方法对目标化合物的提取效果。

1.2.5 HPLC条件 色谱柱:BDS HYPERSIL C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),进样量5 μL,流量1.0 mL/min,检测波长:300 nm,柱温:35 ℃,流动相:A为10%的乙腈,B为纯乙腈,梯度洗脱程序:0-20-25-30 min,0%B-20%B-55%B-0%B。

1.2.6 提取率的计算 公式如下：

R=(C×V)/M[12]

式中:R-白藜芦醇提取率,mg/L;C-待测液中白藜芦醇的浓度,mg/L;V-提取溶剂的体积,mL;M-样品的体积,mL。

1.2.7 数据处理 采用Orgin 8.0进行数据的处理与分析。

2 结果与讨论

2.1 不同有机溶剂提取比较

用不同的有机溶剂提取白藜芦醇类化合物,计算不同有机溶剂对目标化合物的提取率,结果见图1～图4。

2.1.1 不同有机溶剂提取反式-白藜芦醇及其糖苷异构体比较 葡萄酒中的反式白藜芦醇及其糖苷异构体用不同溶剂进行处理,得到的含量各不相同,图1为不同有机溶剂对反式-白藜芦醇苷的提取率比较,图2为不同有机溶剂对反式-白藜芦醇的提取率比较。

图1 不同有机溶剂对反式-白藜芦醇苷的提取率Fig.1 Different organic solvents on the trans-piceid’s extraction rate

图2 不同有机溶剂对反式-白藜芦醇的提取率Fig.2 Different organic solvents on the trans-resveratrol’s extraction rate

表1 氯化钠对白藜芦醇及其糖苷异构体提取效果的影响Table 1 The effect of sodium chloride on the extraction of resveratrol and its glycosides

由图1、图2可知,不同有机溶剂对反式-白藜芦醇及其糖苷异构体的提取率不同。乙酸乙酯、乙酸乙酯∶正己烷(90∶10)较之其他有机溶剂对反式-白藜芦醇及其糖苷异构体提取率最好,其中乙酸乙酯的提取效果最好,提取率可达3.60 mg/L和7.32 mg/L,而乙酸乙酯∶正己烷(10∶90)对反式-白藜芦醇及其糖苷异构体的提取率最低,仅有0.38 mg/L和0.37 mg/L。由此可见,乙酸乙酯的含量对提取葡萄酒中反式-白藜芦醇及其糖苷异构体的影响很大。

2.1.2 不同有机溶剂提取顺式-白藜芦醇及其糖苷异构体比较 图3为不同溶剂对顺式-白藜芦醇苷的提取率比较,图4为不同有机溶剂对顺式-白藜芦醇的提取率比较。

表3 乙酸乙酯和双水相体系提取白藜芦醇及其糖苷的提取率比较(%)Table 3 The comparison of extraction rate of resveratrol and its glycosides from ethyl acetate and aqueous two phase systems(%)

图3 不同有机溶剂对顺式-白藜芦醇苷的提取率Fig.3 Different organic solvents on the cis-piceid’s extraction rate

图4 不同有机溶剂对顺式-白藜芦醇的提取率Fig.4 Different organic solvents of the cis-resveratrol’s extraction rate

乙酸乙酯萃取葡萄酒中反式-白藜芦醇苷和顺式-白藜芦醇苷的提取率可以达到90%以上,对反式-白藜芦醇和顺式-白藜芦醇的提取率低于80%。双水相体系对白藜芦醇及其糖苷异构体四种目标化合物的萃取率低于47%。

3 结论

比较了不同有机溶剂和硫酸铵乙醇水溶液的双水相体系对葡萄酒中白藜芦醇及其糖苷异构体提取结果,结果表明,乙酸乙酯对白藜芦醇及其糖苷异构体的提取率较高,在乙酸乙酯中加入NaCl可减少白藜芦醇及其糖苷异构体的损失。用乙酸乙酯提取白藜芦醇操作简单,结果稳定,误差小,提取率高,具有实际的应用价值。

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由图3、图4可知,不同有机溶剂对目标化合物的提取效果不同,其中乙酸乙酯对顺式白藜芦醇及其糖苷异构体的提取效果尤为突出,提取率可达11.71 mg/L和9.55 mg/L。乙酸乙酯比乙醚和氯仿提取白藜芦醇及其糖苷异构体含量高的原因可能是由于乙醚和氯仿在大于20 ℃的室温下挥发性较大,化学性质极不稳定,遇光即变质,因此其溶剂损失和对环境的污染比乙酸乙酯严重,而乙酸乙酯比乙酸乙酯和二氯甲烷或者正己烷混合液提取白藜芦醇及其糖苷异构体含量高的原因可能是在本实验条件下乙酸乙酯比混合液稳定。

2.2 氯化钠对乙酸乙酯萃取结果的影响

表1为氯化钠对乙酸乙酯萃取葡萄酒中顺、反白藜芦醇苷其糖苷异构体的效果影响比较(峰面积表示)。

由表1可知,不加NaCl与加NaCl相比,峰面积会有一定幅度的下降,因此不加NaCl会造成部分目标化合物的损失。其原因可能为饱和氯化钠溶液极性比水大,有利于有机相和水相的分离,即盐析,抑制形成乳化层,有利于萃取。有些物质在有机相和水相中的分配比不太大时,可通过加入无机盐氯化钠,减少化合物在水相中的溶解度,以此来提高对白藜芦醇及其糖苷异构体的萃取率。

2.3 双水相体系的选择

表2为不同双水相体系的分相效果。

表2 不同双水相体系的R值比较Table 2 R value of different aqueous two phase system

由表2可知,在磷酸氢二钾、硫酸铵存在条件下,甲醇、乙醇、正丙醇溶液的分相效果比较好,可归结高价盐的双水相体系比低价盐的分相效果比较好。考虑到葡萄酒中存在乙醇,且白藜芦醇及其糖苷异构体易溶于乙醇,故选乙醇作为双水相体系的有机相较好;考虑到在酸性条件下,白藜芦醇以分子态存在,比较稳定;在碱性条件下,白藜芦醇容易变性失活[14],故选择硫酸铵对乙醇溶液作为双水相体系。

2.4 乙酸乙酯和双水相萃取结果对比

表3为两种方法对葡萄酒中白藜芦醇及其糖苷异构体的提取率比较。

由表3可知,乙酸乙酯对于葡萄酒中的白藜芦醇及其糖苷异构体的提取率远高于双水相体系,用

Different solvents extraction of resveratrol and its glycosides in wine

WANG Mi,ZHAO Ran,LIU Lin,REN Xiao-yu,SUO Ran

(College of Food Science and Technology,Agricultural University of Hebei,Baoding 071001,China)

Resveratrol and its glycoside isomer are almost insoluble in water but easily soluble for a majority of organic solvent. Comparison of ethyl acetate,chloroform,ethyl ether,the mixed solution of ethyl acetate,hexane and dichloromethane and aqueous two-phase system of wine in resveratrol and piceid were compared. The results showed that the ethyl acetate was superior to the other solvents in the extraction of the target compounds,the extraction rate of resveratrol glucoside could reach more than 90% and the resveratrol extraction rate lower than 80%. Ethyl acetate extraction operation was simple,high extraction rate and feasible.

resveratrol;piceid;extract;ATPS

2016-04-29

王宓(1991-)，女，在读硕士研究生，研究方向：食品工程，E-mail:1124855075@qq.com。

TS262.6

A

:1002-0306(2017)04-0087-04

10.13386/j.issn1002-0306.2017.04.008