食品中微生物快速检测技术发展概况

姚松坪，燕荣，杨少华，彭津津，刘国庆，*

（1.合肥工业大学化工与食品加工系，安徽合肥230009；2.重庆三峡职业学院动物科学系，重庆404155）

食品中微生物快速检测技术发展概况

姚松坪1，燕荣1，杨少华1，彭津津2，刘国庆1，*

（1.合肥工业大学化工与食品加工系，安徽合肥230009；2.重庆三峡职业学院动物科学系，重庆404155）

食品工业发展迅速，但同时食品安全事故也频频发生，因此越来越多的人开始关注食品安全。引起食品安全问题的因素有很多，其中由微生物引起的食品腐败是主要因素。如何快速检测食品中的微生物已经成为研究热点。综述几种目前在世界范围内比较先进的检测技术，比起传统的检测手段，更加方便快捷，灵敏度更高。

微生物；快速检测；食品安全

众所周知，食物的供给是人类赖以生存和发展的必要条件，所产生食品安全问题的重要性不言而喻。目前全世界都已经开始关注食品安全问题。在众多的食品安全事件中，最主要的原因就是微生物及其产生的各种毒素，产生的后果也是最为严重的。如“英国疯牛病事件”、“香港禽流感事件”、“法国李斯特氏菌病”等。这些食品污染几乎都是由致病微生物引起。通常能引起食源性疾病的病原体主要有：副溶血性弧菌、沙门氏菌、大肠杆菌、肉毒杆菌以及黄曲霉等[1]。因此，为了快速准确地检测这些病原微生物，需要我们进一步发展和完善食品检测技术和相关的检测系统。

一般情况下，要检测食品中的微生物多用琼脂平板培养法，这种方法主要是用培养基对微生物进行培养、分离和纯化，然后做相关生化鉴定，操作过程复杂并且费时费力，一般需2 d～3 d才能完成试验并给出结果[2]，无法适应快速检测的需求。因此，研究和建立新的技术和检测方法至关重要。准确、快速、特异的食品微生物检测技术已越来越受到世界各地科学家们的关注。随着生物相关技术和微电子技术的发展，微生物快速检测手段也有了较大的突破[3]。目前比较常见的微生物快速检测方法主要有综合应用免疫学、化学、生物化学、生物物理学、微生物学以及血清学试验等技术，进而实现对微生物的分离、纯化和鉴定，比起传统的检测手段，快速检测更加快捷、方便、灵敏[4]。快速检测食品中金黄色葡萄球菌相关系统的连接示意图见图1[5]。

图1 金黄色葡萄球菌快速检测系统示意图Fig.1 Sketch of rapid detection system of Staphylococcus aureus

1 分子生物学技术

1.1 PCR技术

PCR技术即聚合酶链式反应，是上世纪80年代兴起的一种体外快速扩增技术，在较短的时间内就可扩增数以百万倍的目标基因片段。PCR技术因拥有轻便、快速、较强特异性和高灵敏度等优点，现已普遍应用于食品微生物的快速检测中，特别适用于突发性食品安全事件、要求快速给出鉴定结果的检测工作以及不易培养或常规方法难以检测的微生物[6]。

Delibato等人根据沙门氏菌的ttrRSBCA基因设计相应的底物及探针，并运用该方法对大量细菌和多个肉样进行检测分析，结果显示检测特异性为100%[7]。李金峰[8]等利用多重荧光PCR技术特异性的检测出了肉类中的李斯特菌、沙门菌和大肠杆菌O157∶H7。该方法简单、快速，能同时检测到反应系统中的多个目标序列，可以节省时间、人力、物力和财力，同时避免造成污染。然而，尽管其具有高灵敏度、快速等优点，但检测的顺利进行更是依赖于平稳、昂贵、复杂的精密仪器设备，因此严重限制了该技术在我国食品检测机构的大面积推广及其应用。

1.2 基因芯片技术

基因芯片是一种生物芯片，该技术是通过对微电子技术和分子生物学的综合应用，使得被标记的基因探针和寡核苷酸发生杂交反应，而后使用相关的检测系统对芯片进行扫描，检测反应信号的强弱，因此实现对被测样本中的微生物进行定量以及定性分析。基因芯片技术具有快速、准确、方便的特性，现已被广泛的应用到了食品微生物及环境微生物污染的检测中。何洋等使用该技术手段，快速鉴定出食品中的金黄色葡萄球菌[9]，其研究表明该技术具有较强的特异性和稳定性，仅需7 h便可检测出样本中的金黄色葡萄球菌，具有较强的实用性。

2 免疫技术

2.1 酶联免疫法

酶联免疫法是一种能同时实现抗原-抗体免疫反应的特异性和酶催化反应高效性的固相酶免疫检测方法，也是相关测定手段中应用最广的技术。其特点主要有：反应灵敏准确、检测简单、分析结果真实可靠及费用低等，同时，该方法也可以实现同时对大量样品进行分析，因此也广泛应用在食品检测中。赵志晶等[10]建立了一种双抗酶联免疫法，专门用于检测食品中的大肠杆菌O157∶H7，该方法具有很高的灵敏度，在鸡肉与牛奶的污染样品中检出大肠杆菌达到0.1CFU/g（CFU/mL）。

2.2 免疫磁性微球法

免疫磁性微球是一种表面偶联有单克隆抗体的磁性微球，其主要特点是孔径小，超顺磁性等。现已被广泛应用在细胞分离等技术方面。其原理是，免疫磁性微球可以选择性地与靶物质结合，使其具有磁性反应的特性，并将特异性抗体与磁性颗粒相耦合，这样颗粒就能与样本中待检测的微生物发生特异性结合，当此复合物经过一个磁场装置时，这种磁性颗粒就会在外加磁场的作用下，向磁极方向运动，其表面吸附的致病微生物也会随之运动，这样就使致病微生物得到分离和富集，从而与其他复杂物质分离开来[11-12]。

在日常食品分析中，待测样品通常为固液混合物，但是传统手段很难将其中少量的微生物有效分离开来。而免疫磁性技术凭借其独特的性能很好地解决了这一问题，目前已经广泛应用在食品安全检测和相关的研究中。Skjerve等[13]利用该技术从乳、肉制品中分离沙门氏菌，结果显示此方法检测限为10个/g～20个/g细菌。

3 代谢技术

3.1 ATP生物发光法

ATP（adenosine-triphosphate，ATP）生物发光法主要用于活菌计数，其原理是：ATP作为“能量货币”广泛的存在于各种有生命的有机体中，而且ATP的含量在活细胞中是恒定的，活的细菌体中也有ATP，当细菌死亡后，在细胞内相应酶的作用下，ATP将很快被分解掉[14]。因此，检测ATP的浓度就可推出微生物的数量。生物发光法不需要培养微生物，而且荧光分光光度计是便携式的，操作简单，更适合现场测试，在几分钟内可检测出结果，因此ATP生物发光法已被用于食品安全的快速检测，同时，该技术也被广泛用在HACCP体系中关键控制点的检测。

ATP生物发光技术现已多用于肉及肉制品杂菌污染的测定、饮料中微生物的测定[15]等。目前在欧美等国家，自动ATP生物发光技术已广泛应用于原奶产业中的活菌数检测、UHT奶的活菌数检测、设备的清洁度评价以及产品保质期的计算等[16]。

3.2 微热量计技术

微热量计技术[17]主要利用细菌在不同繁殖阶段时热量的变化对细菌进行检测的一种新技术。由于不同的微生物代谢过程不同，产生的热量就不同，测得的热量曲线就不同，把记录的各不相同的热量曲线作为其特征“指纹图”[18]，将实际测量的热曲线与标准指纹图对比即可分离鉴别微生物。在实际生产中，利用该技术对牛奶生产中几种常用的乳酸菌进行微热量研究，很快就可测得相应细菌的“指纹图”，因此与乳品检测常规方法相比，该方法检测更快速而且重现性更好[19]。

4 生物传感器

生物传感器主要利用生物化学和传感技术，其基本组成为识别元件，信号转换器和电子测量仪。其中识别元件主要有酶、抗体及细胞等。经过一定处理后的样品自由扩散进入识别元件，经过特异性分子识别后与对应元件发生结合，并产生生物学信号，之后经过信号转换器将生物信号转化为光信号或电信号，然后通过电子测量仪的放大和输出，即可达到检测目的[6]。

生物传感器具有较多优点，例如，具有较好的稳定性，低成本，高选择性，高灵敏度，可以在一个复杂的系统快速在线监测和连续检测大量样品。Ercole[20]等研制出一种以电位交互为基础的生物传感器，其核心部件是转换元件，采用一种以光寻址的电位传感器。大肠杆菌在繁殖过程中会产生NH3，该生物传感器主要通过检测因氨气的产生而导致的pH值的变化来检测样品中的大肠杆菌，相比传统的菌落记数法，此方法更加灵敏、快速，可以在90min内完成检测，最低检出限为10个/mL。

5 蛋白质指纹图谱技术

蛋白质指纹图谱技术是由蛋白质组学的兴起而发展起来的一种新技术，该技术主要是通过构建微生物蛋白特征指纹图谱数据库系统，使用专门的服务器和客户端处理数据。经简单处理过的微生物菌落，使用专用质谱仪，将获得的质谱图直接输入数据库中进行检索，与数据库中收录的已知微生物的标准质谱图进行比较，即可分析出目标微生物的种类。

该方法具有很强的通用性，可以用来检测多种微生物，而且样品不需要进行革兰氏染色、氧化酶实验等，检测速度更快更方便，且通量高。目前美国农业部以及其他欧美高校及研究所等已将该技术应用到了食源性致病菌微生物检测及实际食品微生物检验工作中[21-22]。

6 快速检测方法的不足

通过以上对不同检测技术的分析可知，不同的快速检测技术有其独特的优势和最佳的使用范围，很多的快速检测技术具有食品专一性，对于一个特定的食品检测性能最佳。但与此同时，许多检测手段又在某些方面存在一定的局限性。比如，PCR及其衍生技术所需的仪器设备价格非常昂贵，非一般实验室能承受，所以限制了其在我国食品检测领域的大面积推广及应用；基因芯片技术不仅仪器设备成本高，而且操作过程对实验人员的要求也比较高；很多检测手段不能同时做到“定性”和“定量”分析；免疫学方法虽然速度较快、灵敏度也较高，但容易呈现假阳性、假阴性[23]。所以，现在有关食品微生物快速检测亟待解决的问题主要是降低成本，提高自动化水平，降低对操作人员的要求与束缚，同时，最主要的问题是要提高检测设备的灵敏度，增强对微生物的识别特异性，增强设备的通用性等。

7 展望

本文仅讨论分析了众多新型检测技术中几种较为常见的技术，还有许多新技术有待于进一步学习与研究，如阻抗技术[24]、噬菌体鉴定技术、流式细胞仪（FCM）和固相细胞计数（SPC）法[25]等。随着世界食品工业的高速发展，各国研究人员越来越重视强化食品质量控制、加强卫生检验力度、提高应急处理突发性食品安全事件的能力等，纷纷研究和建立快速检测食品微生物的方法以满足社会的需求。要保证食品安全生产、流通，就需要建立更有效、更灵敏、更快速的微生物检测技术。相信随着各个学科的不断发展，学科之间的交融不断深入，以及越来越多的新型快速检测技术的出现，可以满足食品安全等方面的各种不同的需求。预期在不远的将来，会出现更多的新型快速检测技术应用到实际生产及生活中，能更好地为人类食品公共卫生提供保障。

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Development Situation on Rapid Detection of Food Microorganism

YAO Song-ping1，YAN Rong1，YANG Shao-hua1，PENG Jin-jin2，LIU Guo-qing1，*
（1.Department of Chemical and Food Processing，Hefei University of Technology，Hefei230009，Anhui，China；2.Animal Science Department，Sanxia Vocational College of Chongqing，Chongqing404155，China）

With the rapid development of food industry，food safety accidents occur frequently.Therefore，food safety is being concerned by increasing consumers.Furthermore，there are many factors influencing the problem of food safety.Of these，food spoilage cause by microorganism may be amain factor.How to detect the microorganisms rapidly in food is still a hot research topic.Thus，several advanced detection technologies were summarized.Compared with the traditional detection methods，these methods were more convenient，faster and more sensitive.

microorganism；rapid detection；food safety

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.04.045

2016-05-31

安微省重大科技项目（07010301017）；大学生创新项目（201510359079）

姚松坪（1994—），男（汉），在读本科生，食品质量与安全专业。

*通信作者：刘国庆（1963—），男，教授，主要从事农产品生物化工研究。