“藏灵菇”酸乳中优势乳酸菌的分离鉴定

柯晓静，于宏伟，郭润芳

（河北农业大学食品科技学院，河北保定071000）

“藏灵菇”酸乳中优势乳酸菌的分离鉴定

柯晓静，于宏伟，郭润芳*

（河北农业大学食品科技学院，河北保定071000）

利用碳酸钙平板法从藏灵菇菌块为发酵剂制备的发酵酸乳中分离到2株产酸细菌，对其进行形态、生理生化测定及16S rRNA序列分析。结果表明，发酵凝乳中的这两株优势乳酸菌是乳酸乳球菌乳酸亚种。本研究结果为开发稳定的优良发酵剂提供菌种资源，并为进一步研究藏灵菇酸奶的保健功能奠定基础。

藏灵菇；优势菌；乳酸菌；分离鉴定；16SrRNA

藏灵菇菌是一种民间广为流传的天然发酵剂，外形酷似米粒，乳白色、胶质状，上面栖息着多种微生物。将藏灵菇在牛奶中培养，体积会增大很多，形状如盛开的雪莲[1]，所以有人称之为西藏雪莲。长期饮用其泡过的牛奶，可以调整肠内菌群，改善人体胃肠环境，增强免疫力，补充维生素。藏灵菇有良好的发酵特性，它与传统的酸奶或用其他纯种乳酸菌发酵剂制成的产品有很大不同，最显著的特征是除乳酸发酵外，还伴有轻微的由酵母菌引起的酒精发酵，是一种集酸味、醇味为一体的新型发酵乳制品[2]。

“藏灵菇”虽然在民间流行很久，可是一直很少有专业人员对其进行研究，藏灵菇酸奶是一种自然发酵乳，菌相多样，发酵原理跟开菲尔粒相似。在整个发酵周期中优势菌体是在变化的，由于发酵乳风味独特，所以不被有些人接受。因此，了解灵菇菌的构成、发酵优势菌群以及发酵代谢产物，才能改进发酵方式，改善风味，使灵菇酸奶走进市场。刘宇峰等研究了藏灵菇菌体中的菌相，结果发现，藏灵菇菌是以2种真菌和3种乳酸菌为主体构成的块状共生菌系，酵母假丝和营养体构成菌块中，乳酸菌分布在菌块外周[3]。利用藏灵菇作为发酵剂，可能存在复杂的牛乳发酵过程。本研究以实验室保存的“藏灵菇”做为发酵剂对脱脂奶进行发酵，并从发酵后的凝乳中分离出优势乳酸菌，，并进行生理生化和16SrRNA的分子检测，为了解灵菇菌发酵凝乳过程，开发稳定的酸奶优良发酵剂，进行工业化生产灵菇酸奶提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 藏灵菇菌块

藏灵菇菌块为河北农业大学发酵食品实验室保藏。将藏灵菇用无菌水冲洗干净后，整体菌块呈乳白色，并有颗粒状突起，用手捏有弹性，拉伸有丝状物相连。

1.1.2 菌株培养条件

灵菇菌块放置在10%脱脂乳培养基（115℃灭菌15min）中，37℃培养，用于活化菌株及制备发酵酸乳。乳酸菌分离采用含CaCO3的MRS培养基。大肠杆菌E.coli JM109生长在LB培养基，37℃恒温培养。

1.1.3 试剂

生理生化检测管：北京路桥公司；限制性内切酶NotⅠ、EcoRⅠ、Taq DNA聚合酶、T4DNA连接酶、pMD18-T、DNA Marker2000、IPTG、X-Gal、gold view：TaKaRa公司产品；UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒、氨苄青霉素：北京天泽公司；PCR引物合成与测序由华大基因公司完成。

1.2 试验方法

1.2.1 乳酸菌的分离纯化

乳酸菌的分离参照《乳酸细菌分类鉴定及实验方法》[4]。把藏灵菇接种到脱脂乳培养基中，凝乳后吸取1mL的凝固乳稀释到10-9，取各稀释度1mL采用倾注法接种于冷却到60℃的含CaCO3的MRS培养基中，放于37℃培养箱中培养至长出透明圈。

1.2.2 显微形态、生理生化测定

挑取产生透明圈的菌落在MRS培养基中划线纯化，观察纯化后单菌落的特征与个体显微形态，并做H2O2酶试验、革兰氏染色及生理生化实验测试，以河北农业大学发酵食品实验室保存的嗜热链球菌保加利亚乳杆菌做对照。

生命体征（体温、心率、呼吸、血压）及实验室检查（血常规、尿常规、肝肾功能及心电图）的组间比较，差异均无统计学意义，实验室相关的异转率的组间比较，差异均无统计学意义。

1.2.3 乳酸菌16s rRNA基因的扩增

采用液氮冻融-CTAB法提取乳酸菌基因组DNA[5]。以提取的基因组DNA为模板，以通用引物为特异性上下游引物进行PCR扩增。正向引物为PLs：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；反向引物为PLa：5'-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3'。

PCR反应体系为：10×PCR缓冲液（含Mg2+）2.5μL，dNTP混合物（2.5mmol/L）2μL，PLs（10mmol/L）1.0μL，PLa（10mmol/L）1.0μL，基因组DNA 1.0μL，Taq酶（2.5U/μL）0.5μL，补充ddH2O至25μL反应总体积。

PCR循环条件为：94℃5min，94℃30 s，55℃30 s，72℃90 s，30个循环后，于72℃延伸10min。

用UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒回收并纯化PCR产物，将回收纯化后的PCR基因片段与pMD-18T载体连接。连接产物转化入JM109感受态细胞中，并利用蓝白斑筛选出阳性克隆，并对其进行菌液PCR和质粒双酶切验证。

将验证为阳性的质粒送去华大基因公司进行测序，将测序结果在NCBI上进行比对，并下载相似序列做同源树[6]。

2 结果与分析

2.1 乳酸菌的分离

2.2 乳酸菌的显微形态

革兰氏染色后油镜观察（图1）。

图1 菌株的显微形态观察Fig.1 Cell morphologies of strain

由图1可知，菌株SNR-6和SNR-8均为革兰氏染色阳性，圆形或球杆细胞直径为0.7μm，成对或成串存在。二者显微形态一致。

2.3 乳酸菌基因组16s rRNA扩增与序列比对

以提取的乳酸菌SNR-6和SNR-8的基因组DNA为模板，以16s rRNA通用引物为特异性上下游引物进行PCR扩增，扩增结果见图2。琼脂糖电泳显示PCR扩增产物条带为1 500 bp左右，大小与目的条带一致。

图2 16s rRNA的扩增片段Fig.2 Fragment of 16S rRNA

提取阳性克隆质粒，并进行酶切验证，酶切结果如图3所示，质粒DNA经限制性内切酶EcoRⅠ和NotⅠ消化后，酶切产物出现两条片段（图3），较小的一条为目的带（大约1 500 bp），较大的为载体带（大约2 700 bp），可以确定目的基因已经插入载体中。

图3 重组质粒的酶切验证Fig.3 Restriction analysis of recombinant plasmid

将质粒送到华大基因公司进行测序，将所扩增SNR-6号和SNR-8号乳酸菌16S rRNA序列在Gen－Bank（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）中与乳酸菌已发表的16SrRNA基因序列进行同源序列搜索，以比较试验菌株与已知菌株在相应区域序列同源性。根据同源序列比对结果，下载相关菌种的16SrRNA基因序列，与试验菌株一起用DNAMAN6.0软件进行分析并做同源树，测定结果发现这两株菌16SrRNA序列完全一致。

图4 分离的乳酸菌与其它乳酸菌的同源树Fig.4 Homologous tree of SNR-6with other Lactobacillus sp.

将结果递交Genebank进行Blast，结果显示与乳酸乳球菌的同源性最高，达100%；而与其它乳球菌和乳杆菌的同源性分别为99%、86%。因此可以初步判断为乳酸乳球菌。乳酸乳球菌有3个亚种，分别为乳酸亚种，乳脂亚种和霍氏亚种，进一步做同源进化树分析（图4），结果发现分离得到的SNR-6和SNR-8菌株与3个亚种的同源性都高达100%。

2.4 乳酸菌的生理生化结果

为了进一步证实上述的结果并确定属于哪个亚种，针对性地做了生长条件和生理生化测定，其最适生长温度30℃，而45℃不生长，4.0%NaCl生长，6.0% NaCl不生长。糖发酵及其他生化指标结果见表1。经生理生化进一步确定，SNR-6和SNR-8菌株测定结果一致，综合形态、生理生化及16S rRNA比对结果，认为SNR-6和SNR-8菌株同为乳酸乳球菌乳酸亚种（Lactococcus lactis subsp.lactis）。

表1 鉴定乳酸乳球菌的生理和其它性状Table1 Physiological-biochemistrical characteristics of SNR-6 and SNR-8

3 结论与讨论

已有研究报道藏灵菇菌是以耐热可鲁维酵母、亚罗可鲁维酵母和乳酸杆菌、嗜酸短乳杆菌和乳酸链球菌为主体构成块状共生菌系，以酵母假丝和营养体构成菌块中心，乳酸菌分布在菌块外周[7]。本研究从灵菇菌发酵凝乳后的酸奶中分离出优势乳酸菌为乳酸链球菌，说明凝乳过程中乳酸链球菌起了重要作用。这与其它报道的不尽相同，南京农业大学食品科技学院通过对150株分离自藏灵菇中的菌的PCR-DGGE指纹图谱分析，获得了8组乳酸菌和5组酵母菌，进一步的序列分析和相似性比较，确立了藏灵菇发酵奶中的优势菌为肠膜明串珠菌、乳酸乳球菌、开菲尔乳杆菌、干酪乳杆菌和克鲁维酵母，单孢酵母、啤酒酵母、假丝酵母发酵后期成为优势菌[8]。分析本研究结果，推测优势乳酸菌数量较少的原因可能有两个：第一，有些报道是从藏灵菇菌块及其发酵乳中分离的，因此种类较多；第二，发酵凝乳过程中每个时期的优势菌体不一样。本试验只是对凝乳后的发酵乳进行了分离，属于发酵后期，此时期发酵乳优势乳酸菌种类较少。下一步应该对菌块和整个发酵周期做认真的研究，这样才能真正理解灵菇菌发酵凝乳过程，开发稳定的酸奶优良发酵剂，也可以尽早的将其进行产业化生产。

[1]林丽萍,陈卫平,罗秋水,等.藏灵菇增殖条件及发酵性能的研究[J].食品科技,2014,39(3):13-16

[2]罗章,陈历俊,陈历水,等.西藏乳及发酵乳制品中乳酸菌与酵母菌分布[J].食品工业科技,2013,34(11):392-395

[3]贺银凤.传统发酵乳制品中乳酸菌和酵母菌的互作关系[J].中国乳品工业,2010,38(10):43-45

[4]凌代文.乳酸细菌分类鉴定及实验方法[M].北京:中国轻工业出版社,1999

[5]FM奥斯伯,RE金斯顿,JG塞德曼,等.精编分子生物学实验指南[M].马学军译.北京:科学出版社,2005:22-27

[6]王延祥,秦伟,李平兰.利用16S rRNA序列鉴定分离自开菲尔粒的一株乳杆菌[J].中国农业大学学报,2008,13(1):20-23

[7]夏菲.西藏灵菇复合发酵剂的研究[D].杨陵:西北农林科技大学, 2013

[8]周剑忠,董明盛,江汉湖.PCR-DGGE指纹技术与分离技术结合筛选藏灵菇奶发酵过程的优势菌[J].中国农业科学,2006,39(8): 1632-1638

Isolation and Identification of the Dominant Lactic Acid Bacteria in‘Tibetan Kefir’Yogurt

KE Xiao-jing，YU Hong-wei，GUO Run-fang*
（College of Food Science and Technology，Agricultural University of Hebei，Baoding071000，Hebei，China）

Two acid-producing bacteria were isolated from the yogurt prepared by fermentation agents of Tibetan kefir using calcium carbonate plate method.These two isolates were identified as Lactococcus lactis subsp. lactis based on the characterization of morphology，physiology and biochemistry，and 16S rRNA sequence analysis.The present research provide strain resources for fermentation agents，and also lay a foundation for further studying on health function of Tibetan kefir yogurt.

Tibetan kefir；dominant bacteria；lactic acid bacteria（LAB）；isolation and identification；16S rRNA

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.04.035

2016-05-23

柯晓静（1980—），女（汉），助理研究员，博士，研究方向：食品科学。

*通信作者：郭润芳（1969—），女，教授，主要研究方向：微生物资源开发与利用。