种植窗期子宫内膜微血管密度与胚胎种植结局的相关性探讨〔1〕

张雪洛，陈艳花，武学清

(山西省妇幼保健院生殖医学中心，山西 太原 030012)

种植窗期子宫内膜微血管密度与胚胎种植结局的相关性探讨〔1〕

张雪洛，陈艳花，武学清

(山西省妇幼保健院生殖医学中心，山西 太原 030012)

目的：探讨种植窗期子宫内膜微血管密度(MVD)对评价胚胎种植结局的价值。方法：选择行体外受精-胚胎移植(IVF-ET)治疗的患者60 例，根据新鲜周期是否妊娠分为临床妊娠组(30 例)及未妊娠组(30 例)。全部患者均于行IVF-ET前一个月经周期排卵后的第7天用一次性宫腔组织吸引管获取子宫内膜组织，采用免疫组化的方法进行MVD测定。结果：临床妊娠组MVD高于未妊娠组，差异有统计学意义。未妊娠组HCG日孕酮高于临床妊娠组，临床妊娠组三线型子宫内膜比例高于未妊娠组，差异均有统计学意义。结论：HCG日孕酮提前升高，导致妊娠率下降。种植窗期子宫内膜微血管密度对预测妊娠结局有一定的临床意义。

体外受精-胚胎移植；子宫内膜；微血管密度；妊娠结局

近年来，辅助生殖技术的发展为众多不孕患者解决了生育难题，但仍有部分患者出现反复的妊娠丢失。有报道称反复移植失败与子宫内膜的微环境有一定的关联[1]，且子宫内膜良好的血供是着床成功的必要条件。因此种植窗期子宫内膜微血管密度成为近年来研究的热点。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2016年3月—2016年11月在山西省妇幼保健院生殖医学中心进行体外受精-胚胎移植(IVF-ET)治疗的60 例患者，年龄(30.61±4.34) 岁，具有正常的月经周期，周期21～35 d，经伦理委员会同意，并经患者签署知情同意书。纳入标准：因输卵管因素、男性因素或不明原因的不孕接受IVF-ET助孕的患者。排除标准：排除输卵管积水、子宫内膜受损、卵巢反应不良等明显影响成功种植的因素，排除染色体、解剖、内分泌异常及感染、自身免疫性疾病如类风湿关节炎、甲状腺疾病、红斑狼疮等。根据随访IVF-ET结局是否临床妊娠分成未妊娠组和临床妊娠组。

所有患者均采用常规黄体中期长方案，即排卵后7 d(黄体中期)给予醋酸亮丙瑞林1.25 mg，达到降调节标准后给予促排卵，采用经阴道超声监测子宫内膜变化和卵泡生长情况，当至少有2个卵泡直径大于18 mm时，当晚注射绒促性素1万U，注射后36～40 h左右取卵，体外受精，于取卵后3 d，移植优质胚胎2枚，移植后28 d经阴道B超见到孕囊为临床妊娠，未看见妊囊或生化妊娠者归为未妊娠组。

1.2 标本收集

所有患者均在IVF-ET前一个自然周期的第8天至第10天行阴道超声连续监测卵泡发育，若超声下可见卵泡已排，测定黄体生成素及孕酮，根据激素水平确定为排卵。则于排卵后7 d用一次性宫腔组织吸引管取少许内膜组织，于10%的甲醛溶液固定，石蜡包埋制片。

1.3 试剂

鼠抗人CD34一抗和二抗(北京中杉金桥生物有限公司生产)；立可灵一次性宫腔组织吸引管(C3.1/30-1S型，上海家宝医学保健科技有限公司)；超声仪(ALOKA公司SSD-4000型)。

1.4 方法

切片；烤片，60 ℃1h；脱蜡至水；蒸馏水洗3 min；pH 6.0柠檬酸盐修复液微波炉加热至沸腾，持续加热20 min，室温冷却20 min；蒸馏水洗3 min；3%H2O2抑制内源性过氧化物酶，室温10min；pH7.4 0.01 mol/L PBS冲洗5 min×2次；一抗室温孵育1 h；PBS冲洗5 min×3次；Dako REALTM EnVisionTM二抗孵育孵育30 min；PBS冲洗5 min×3 次；DAB显色，5～10 min；苏木素复染1 min，盐酸酒精分化5 s，自来水返蓝1 min；脱水、透明、封片。以PBS代替一抗为阴性对照。

1.5 微血管密度(MVD)测定方法

子宫内膜MVD测定参照Weildner等[2]微血管密度计数标准：对经CD34单克隆抗体免疫组化处理的切片在Olympus(BX51)正置显微镜下观察，先在低倍镜下(100 倍)扫描整个视野，选择内皮细胞染色棕黄色最密集的3 个区域即微血管形成丰富区域，然后转至高倍镜下(400倍)拍摄5个视野，计数每个视野血管数量，相加求得算术平均数，此平均数代表每张切片中子宫内膜组织微血管密度定量数，即为每高倍视野的血管数。任何一个胞质呈棕染的单个内皮细胞或内皮细胞簇，与周围其他组织有明显界限，无论有无血管腔、无论管腔内有无红细胞均定义为一个微血管，管腔大于8个红细胞直径或有明显肌层者不计数在内。

1.6 统计学方法

采用SPSS13.0统计学软件处理，计量资料采用t检验，计数资料采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 两组一般情况比较

两组患者的年龄、不孕年限、不孕类型、基础促卵泡激素(FSH)、基础促黄体激素(LH)、身体质量指数(BMI)、基础窦卵泡数等一般情况比较差异无统计学意义(P>0.05)(见表1)。

表1 两组患者一般情况分析

2.2 两组临床资料比较

两组患者临床资料比较发现，在Gn启动量，用药天数，人绒毛膜促性腺激素(HCG)日雌二醇(E2)、LH、内膜厚度、类型，获卵数，MII卵率，受精率，优质胚胎率等方面比较差异均无统计学意义(P>0.05，见表2)。但未妊娠组HCG日孕酮(P)明显高于临床妊娠组，差异有统计学意义。且临床妊娠组移植日三线型内膜例数明显高于未妊娠组，差异有统计学意义。

表2 两组患者临床数据分析

2.3 两组子宫内膜MVD比较

CD34标记的子宫内膜MVD结果见图1～图4(图1和图2为未妊娠组，图3和图4为临床妊娠组)。临床妊娠组MVD为(12.3±4.5)条/HP，未妊娠组为(9.1±0.9)条/HP，临床妊娠组MVD高于未妊娠组，差异有统计学意义。

3 讨 论

目前认为影响IVF-ET结局的主要因素有胚胎质量、子宫内膜容受性(ER)和胚胎发育与子宫内膜的同步化。子宫内膜容受性[3]是指子宫内膜允许胚胎定位、黏附、穿透，并诱导间质发生改变，从而允许胚胎着床的状态。评价子宫内膜容受性最准确的方法是内膜活组织检查。但常规的子宫内膜活组织检查方法对内膜损失较大，本实验中使用一次性宫腔组织吸引管吸取内膜组织，这种方法具有安全、有效、创伤小、操作简单、出血量少等优点，并且可以实现预移植的目的。

图1 CD34标记的未妊娠组子宫内膜微血管(SP×100)

图2 CD34标记的未妊娠组子宫内膜微血管(SP×400)

图3 CD34标记的妊娠组子宫内膜微血管(SP×100)

图4 CD34标记的妊娠组子宫内膜微血管(SP×400)

子宫内膜良好的血供是评价内膜容受性的重要方面[4]。MVD是目前公认的评价血管活跃程度的指标[5]。MVD越高说明新生血管越丰富。而人类白细胞抗原CD34是一种小血管相关的抗原，为血管内皮细胞的特异性标记物，其灵敏度及特异度较高。本研究中妊娠组MVD明显高于未妊娠组，说明妊娠组子宫内膜的血管生成丰富，有较丰富的血液供应，为胚胎的成功着床提供充足的营养，提高了子宫内膜的容受性。有研究证实，同样以CD34为标记物，子宫内膜癌中的MVD显著高于正常子宫内膜[6]，并认为丰富的血管生成是肿瘤生长和转移的必要条件。因此对于因子宫内膜血管生成不良而导致妊娠率下降患者可以考虑使用促血管生成因子来改善血管生成情况，丰富内膜的血供，从而提高妊娠率。

胚胎发育和子宫内膜的同步化也是成功妊娠的必要因素。一项大样本研究发现[7]，卵巢功能正常人群，HCG日孕酮大于1.75 ng/mL，持续率呈下降趋势。考虑孕酮的提前升高，导致子宫内膜和胚胎发育不同步，内膜对胚胎的容受性下降，最终妊娠失败。本研究发现，HCG日未妊娠组孕酮明显高于妊娠组，推测孕酮的提前升高可能是患者最终流产的高危因素。Melo等[8]对赠卵周期的自身对照研究显示孕酮升高不影响卵子及胚胎质量。本研究中两组患者的MII卵率、受精率及优质胚胎率比较差异无统计学意义，说明孕酮的升高对卵子及胚胎质量影响不大。

目前对于内膜的形态与IVF-ET妊娠率的关系存在广泛争议，且内膜形态的评判受监测者主观评判性影响较大，但大部分学者仍认为三线型子宫内膜的妊娠率偏高。李素春等[9]发现，种植窗口期宫腔镜下子宫内膜的形态能较好地预测妊娠率及妊娠结局。葛明晓等[10]认为，促排卵周期的月经第1天至第2天行子宫内膜搔刮术能改善子宫内膜的形态，显著提高妊娠率。虽然本研究结果也显示三线型子宫内膜妊娠率较非三线型子宫内膜偏高，但由于样本量较少，有待于进一步证实。

本研究通过对比临床妊娠组和未妊娠组的子宫内膜微血管密度证实，子宫内膜丰富的血供有利于妊娠率的提高。但由于样本量有限，对此结论的说服力欠佳。且本实验缺少阴道超声下子宫内膜血流参数的测定，有待于进一步的研究。

[1]ALFREDSSON J.Incidence of spontaneous abortion following artificial insemination by donor [J].Fertil，1988，33(1)：241-245.

[2]WEIDNER N，SEMPLE J P，WELCH W R，et al.Tumor angiogenesis and etastasis-corelation in invasive breast carcinoma[J].N Engl J Med，1991，324(1)：1-8.

[3]RAGA F，BONILLA F M，CASA E M，et al.Assessment of endometrial volume by three-dimensional ultrasound prior to embryo transfer：clues to endometrial re-ceptivity[J].Hum Reprod，1999，14(11)：2 851-2 854.

[4]SMITH S K.Regulation of angiogenesis in the endometrium[J].Trends Endocrinol Metab，2001，12(4)：147-151.

[5]WEIDNER N，SEMPLE J P，WELCH W R，et al.Tumor angiogenesis and etastasis-corelation in invasive breast carcinoma[J].N Engl J Med，1991，324(1)：1-8.

[6]金顺安，刘宁，殷建军.CD105在子宫内膜癌中的表达及临床意义[J].中国妇幼保健，2007，22(33)：4 757-4 758.

[7]XU B，LI Z，ZHANG H，et al.Serum progesterone level effects on the outcome of in vitro fertilization in patients with different ovarian response：an analysis of more than 10，000 cycles[J].Fertil Steril，2012，97(6)：1 321-1 327.

[8]MELO M，MESEGUER M，GARRIDO N，et al.The significance of premature luteinization in an oocyte-donation programme[J].Hum Reprod，2006，21(6)：1 503-1 507.

[9]李素春，冯苗，聂琼英，等.种植窗口期宫腔镜检查对原因不明不孕症患者子宫内膜容受性及妊娠结局的预测价值[J].中华妇产科杂志，2010，45(3)：184-190.

[10]葛明晓，张金玉，李海霞，等.搔刮术对子宫内膜形态不良患者体外受精-胚胎移植临床结局的影响[J].中国妇产科临床杂志，2012，13(5)：352-354.

Relationship between microvessl density and vitro fertilization treatment outcome in the window endometrium of implantation

ZHANG Xueluo，CHEN Yanhua，WU Xueqing

(Reproductive Medicine Center of Shanxi Maternal and Child Health Hospital，Taiyuan 030012，China)

Objective：To evaluate the value of endometrial microvessel density (MVD) in assessing in vitro fertilization(IVF) treatment outcome during the window endometrium of implantation.Methods：A total of 60 patients undergoing in vitro fertilization and embryo transfer (IVF-ET) treatment were analyzed retrospectively.The subjects were divided into clinical pregnancy group (30 cases) and nonpregnant group (30 cases) according to the IVF-ET outcome.Endometrial tissues were collected 7～9 days after the natural ovulation prior to IVF-ET for measurement of the endometrial MVD.Results：The endometrial MVD was significantly higher in the clinical pregnancy group than in the nonpregnant group.The progesterone was significantly higher in the nonpregnant group than in the clinical pregnancy group while the proportion of triple-line pattern endometrial was significantly higher in the clinical pregnancy group than in the nonpregnant group.Conclusion：The progesterone elevation on the day of HCG is negatively related to the pregnancy rate.The endometrial MVD in the window endometrium of implantation has clinical significance in forecast the IVF treatment outcome.

in vitro fertilization embryo transfer；endometrium；microvessl density；the IVF treatment outcome

1671-8631(2017)03-0166-04

〔1〕本课题为山西省妇幼保健院院内课题(项目编号：0102214001)

R717

A

2016-11-23

(本文编辑：王作利)

张雪洛(1987— )，女，黑龙江省绥化市人，硕士学位，住院医师。研究方向：辅助生殖医学。