阿维拉霉素提取工艺的研究

闵江，刘正光，梁景乐，赵学朋，马传亮，赵才兵

（山东胜利生物工程有限公司 山东济宁 272000）

阿维拉霉素是由绿色产色链霉素菌发酵而生成的二氯异扁枝衣酸酯，属于正糖霉素族寡糖类抗生素[1]，可用作猪和肉鸡的饲料添加剂，提高猪和肉鸡的平均日增重和饲料报酬率[2]，也可抑制革兰氏阳性菌，通过与细菌核糖体结合来抑制蛋白质的合成[3]，达到预防动物疾病的效果。因其安全性高，残留率低，对环境无影响等特点，在世界大部分国家和地区得到广泛应用。

目前国内尚无厂家生产阿维拉霉素，该生产技术被美国礼来公司垄断，该公司生产的阿维拉霉素预混剂（10%）和阿维拉霉素预混剂（20%）已经获批进入中国市场。国内关于阿维拉霉素的研究在菌种选育、诱变方面和发酵过程方面较多，鲜有阿维拉霉素提取工艺相关研究。Mertz JL等[4]用丙酮做溶剂浸提阿维拉霉素干菌丝体，浸提液进行脱色漂白，之后加水析出阿维拉霉素晶体，将晶体过滤后，再用乙腈-水重结晶后，过滤、干燥，通过液相色谱分离得到阿维拉霉素纯品。王宏等[5]以有机溶剂浸提含阿维拉霉素的菌丝体，通过结晶、硅胶柱层析、ODS柱洗脱分离、重结晶，抽滤后结晶用纯水漂洗，烘干获得阿维拉霉素纯品。程豪[6]将阿维拉霉素发酵液经过预处理、过滤和烘干得阿维拉霉素干菌丝，将阿维拉霉素干菌丝在一定温度下加入有机溶剂搅拌，过滤得浸提液，将其减压蒸馏得到浓缩浸渍液，然后浸渍液脱色，低温结晶得到阿维拉霉素成品，此工艺可有效提高阿维拉霉素有效组分A、B的含量。袁宗辉等[7]以有机溶剂浸提阿维拉霉素，浸提液减压蒸干后得到阿维拉霉素粗品，然后使用一定比例的丙酮-水、乙醇-水重结晶多次，可得白色的阿维拉霉素纯品，但此法繁琐，收率偏低。鉴于此，笔者对阿维拉霉素提取工艺进行了研究，可为工业化生产阿维拉霉素提供实验数据，以此填补国内空白。

1 材料与方法

1.1 原料

AVL201606006批阿维拉霉素发酵液由山东胜利生物工程有限公司提供。

1.2 主要试剂

4-甲基-2-戊酮（分析纯，上海冀轧实业有限公司）；正己烷（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；乙腈（HPLC，J.T.Baker）；甲醇（HPLC，J.T.Baker）；氢氧化钠（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；磷酸二氢铵（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）。

1.3 主要仪器

液相色谱仪Agilentl200（Agilent公司，美国）；FW-100型万能粉碎机 (上海楚定分析仪器有限公司)；JA31002型电子天平 (上海越平科学仪器有限司)；KDM型调热电热套 (山东鄄城光明仪器有限公司)；Heidolph4000旋转蒸发仪 (海道夫，德国)；DZF-6050型真空干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)；SHB-Ⅲ型循环水真空泵 (郑州长盛实验仪器有限公司)；xutemp型低温恒温液浴循环两用槽 (杭州雪中炭恒温技术有限公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 阿维拉霉素干菌丝体制备 发酵结束后，取适量发酵液，搅拌均匀，加热至90℃保温15min，然后降温至50～60℃，用氢氧化钠溶液将发酵液pH值调至8.0-8.5之间。混匀后再重新测定，以保证过滤过程中pH值维持在8.0-8.5之间，减压过滤，得到的阿维拉霉素湿菌丝体，放在真空干燥箱中烘干，粉碎，备用。

1.4.2 阿维拉霉素提取工艺 取适量阿维拉霉素干菌丝体，用干菌丝体重量7倍体积的4-甲基-2-戊酮溶解，在80℃下提取1h，减压过滤，得一浸液；将得到一浸湿菌渣用干菌丝体重量5倍体积的4-甲基-2-戊酮溶解，在80℃下提取1h，减压过滤，得二浸液；合并一浸液与二浸液，在真空度为0.09MPa，温度为70℃的水浴条件下减压浓缩至浸提液体积的1/3，浓缩液冷却后加入2倍体积正己烷，机械搅拌1h后减压过滤，得到阿维拉霉素湿精粉，放在真空度为0.09MPa，温度为60℃的真空干燥箱中干燥2h，得到白色阿维拉霉素纯品。

1.4.3 阿维拉霉素效价的检测 ①对照品溶液的制备：取阿维霉素对照品适量（约相当于阿维霉素40mg），置100mL量瓶中，加丙酮10mL使溶解，再用乙腈-0.132%磷酸氢二铵溶液（用磷酸调节pH值至7.0）（50∶50）稀释至刻度，制成约含0.4mg/mL的溶液。②供试品溶液的制备：精确称量阿维拉霉素0.02g，放入100mL容量瓶中加入适量丙酮，溶解后用丙酮定容，摇匀、过滤、备用。③色谱条件：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-0.2%磷酸二氢铵溶液（用磷酸调节pH值至3.0）（51∶49）为流动相；检测波长为214nm，进样量10μL。

2 结果与讨论

2.1 4-甲基-2-戊酮对阿维拉霉素溶解能力

在 25℃、40℃、60℃、70℃、80℃、90℃条件下，各取10g阿维拉霉素溶于100mL4-甲基-2-戊酮中，检测阿维拉霉素溶液效价，实验结果见表1。可以看出，温度越高，4-甲基-2-戊酮溶解的阿维拉霉素量越多。

表1 不同温度下阿维拉霉素在4-甲基-2-戊酮中的溶解度

2.2 浸提温度的选择

取适量阿维拉霉素菌丝体，分别在25℃、40℃、60℃、80℃下用4倍体积4-甲基-2-戊酮一次浸提；一浸湿菌渣用2倍体积4-甲基-2-戊酮二次浸提，检测一次浸提液、二次浸提液和干菌渣效价，浸提收率见表2。可以看出，浸提温度对此工艺的影响甚大，温度越高，提取收率越高，菌渣中残留的阿维拉霉素较少，考虑到安全与动力消耗问题，拟选用80℃作为浸提温度。

表2 不同温度下4-甲基-2-戊酮浸提阿维拉霉素收率

2.3 浸提时间选择

取适量阿维拉霉素菌丝体，在80℃下用4倍体积4-甲基-2-戊酮一次浸提；一浸湿菌渣用2倍体积4-甲基-2-戊酮二次浸提，分别在0.5h、1h、2h取样检测浸提液效价，浸提收率见表3。考虑到时间成本与浸提率，两次浸提时间都可以选用1h。

表3 不同浸提时间对浸提率的影响

2.4 浸提料液比选择

在80℃条件下，比较不同料液比(m/v)对浸提率的影响，实验结果见表4。可以看出，阿维拉霉素菌丝体一次浸提与二次浸提时，4-甲基-2-戊酮的使用量越多，浸提率越高，菌渣中残留的阿维拉霉素越少。考虑到溶剂消耗成本、溶剂套用情况、菌渣残留、生产设备承受能力等情况，确定一次浸提料液比为1∶7，二次浸提料液比为1∶5。

表4 不同料液比对浸提率的影响

2.5 浓缩液体积选择

阿维拉霉素两次浸提液合并后，需减压浓缩。本实验考察了浓缩倍数对制得阿维拉霉素产品质量的影响，实验结果见表5。可以看出，浸提液浓缩倍数较大时，制得的阿维拉霉素产品质量较差，颜色较黄；综合考虑，V浸提液∶V浓缩液为 3∶1。

表5 不同用量正己烷对阿维拉霉素产品质量影响

2.6 正己烷用量选择

阿维拉霉素浸提液经过浓缩后，需加入正己烷除油析晶。研究发现，正己烷用量对制得阿维拉霉素产品质量有一定影响，实验结果见表6。可以看出，正己烷用量较少时，除油效果并不理想，制得的阿维拉霉素产品颜色较黄，效价偏低；当V正己烷：V浓缩液为2∶1或3∶1时，所得阿维拉霉素产品性状与效价相近。综合考虑，V正己烷∶V浓缩液为2∶1。

表6 不同用量正己烷对阿维拉霉素产品质量影响

表7 阿维拉霉素制备工艺三批验证结果

2.7 工艺验证

本实验还对此工艺进行了三批验证，实验结果见表7。可以看出，通过此工艺浸提阿维拉霉素菌丝体收率较高，制得的阿维拉霉素纯品含量在1,200U/mg左右，收率在85%以上。

3 结论

通过对浸提温度、浸提时间、料液比、浓缩液体积、正己烷用量等单因素研究，确定了阿维拉霉素提取的最佳工艺：浸提温度为80℃；两次浸提时间都为1h；一次浸提料液比为1∶7，二次浸提料液比为 1∶5；V浸提液∶V浓缩液为 3∶1；V正己烷∶V浓缩液为2∶1。并对此工艺进行了三批验证，结果表明此工艺制得的阿维拉霉素含量和产品收率较高。另外，此工艺所用的有机溶剂均可回收利用，对环境污染较小，能耗及成本较低，操作简单易行，适合工业化生产。■