鸡多种病原混合感染的研究

刘华栋，李婷婷，陆冰洋，王彩先，唐娟，丁树荣，詹丽娥＊

（山西省农业科学院畜牧兽医研究所 山西太原 030032）

2016年10月28日山西省太谷县某养鸡场85日龄的蛋鸡发生疾病。此养鸡场存栏鸡10,000只，由于近期发生疾病，死亡数量剧增，每天死亡数量30～40只，且数量逐日增加。大群鸡精神状态差，采食量和饮水量均下降。场主携带5只发病鸡来笔者研究室诊断，以下是详细诊断内容。

1 临床症状

病鸡喜卧，双翅下垂，伸颈张口呼吸，眼睛紧闭，呈打盹状，反应迟钝，拉黄绿色水样稀便。

2 病理变化

剖检可见喉头水肿且有黄色干酪样分泌物堵塞，几乎接近完全堵死。气管切开可见管腔有黄色脓性分泌物，冲洗去掉分泌物可见气管壁出血，并有散在的溃疡灶和坏死灶。心脏和肝脏有黄色纤维素样分泌物沉淀包裹，肝脏肿大呈现土黄色。腺胃乳头出血，腺胃和肌胃交界处出血。十二指肠呈现散在的枣核样出血，空回肠也有散在的点状出血。盲肠扁桃体出血严重，直肠出血。脾脏肿大。肾脏肿大出血，呈现花斑肾。

3 实验室检查

3.1 鉴别培养（普通培养和鉴别培养）

取病死鸡的心、血液和肝脏样品，无菌划线接种于营养琼脂、麦康凯琼脂和伊红美蓝琼脂上，置37℃恒温培养24h后，可见普通琼脂上形成圆形、隆起、光滑、湿润和灰白色中等大小的菌落，而麦康凯琼脂上形成红色菌落，伊红美蓝琼脂上则形成黑色带金属光泽的菌落。

3.2 病原镜检

挑取单个菌落涂片，革兰氏染色，镜检可见染成红色的短小杆菌。

3.3 生化鉴定

将纯培养的病原菌进行生化鉴定，结果见表1。由表1结果可以判定分离菌为大肠杆菌。盐产碱；NAGA：N-乙酰-β-葡萄糖氨酶；AGAL：α-半乳糖苷酶；PHOS：磷酸酶；GlyA：氨基乙酸芳胺酶；ODC：鸟氨酸脱羧酶；LDC：赖氨酸脱羧酶；IHISa：组氨酸同化；cMT：PE葡萄糖酸酶；BGUR：β-D-葡萄糖醛酸酶；O129R：O/129耐受；GGAA：谷氨酸-甘氨酸-精氨酸芳胺酶；lMLTa：L-苹果酸盐同化；ELLM：ELLMAN；lLATa：L- 乳酸盐同化

表1 分离菌的生化鉴定结果表

3.4 药敏实验

采用K-B试纸扩散法[1]，挑取大肠杆菌单个菌落均匀涂布于整个平板，将含有抗生素的药敏纸片用烧灼灭菌的镊子分别贴于平板表面，纸片之间间隔24mm以上，37℃培养24h后观察结果。测量药敏纸片抑菌圈的直径，参照CLSI手册中的标准作出判断[2]，每次测定均以标准质控菌株ATCC25922作参照。使用18种常规药物对分离到的鸡大肠杆菌进行药物敏感性实验，结果见表2。

由表2结果可见，分离菌对头孢曲松、粘杆菌素中敏，对庆大霉素、安普霉素、链霉素和阿米卡星高敏，其他常用抗菌药物均耐药。

3.5 传染性喉气管炎包涵体检查

无菌条件下取出病鸡喉头和气管黏膜上皮，涂片，在无水甲醇中固定3～5min，姬姆萨氏染色2h，无水甲醇脱色，冲洗，干燥镜检[3,4]，可见上皮细胞核内有包涵体。结合临床症状及剖检病变确定其感染有传染性喉气管炎。

3.6 琼脂扩散试验

采集病鸡喉气管分泌物与鸡传染性喉气管炎高免血清做琼脂扩散试验，置于37℃恒温培养24h后观察，结果被检样品与高免血清孔之间形成清晰的白色沉淀线。

3.7 动物试验

取病死鸡气管分泌物，按1∶5加生理盐水稀释，用棉签蘸取稀释液涂擦喉头和上腭，接种于40日龄易感鸡5只，再用生理盐水接种同日龄鸡5只作对照[5]。1d后即有鸡出现呼吸道症状，3d后全部出现鸡传染性喉气管炎典型的呼吸道症状，流泪，结膜发炎。病理剖检可见喉头和气管出血。对照组未见异常变化。

3.8 ND的PCR鉴定

从发病鸡的肺脏、肝脏、脾脏等器官取样1g，剪碎混匀后取0.05g研磨，8,000rpm离心后取上清，使用新城疫病毒通用型RT-PCR检测试剂盒检测NDV，取已处理的样品，加入裂解液600μL，充分颠倒混匀，室温静置3～5min。将液体吸入吸附柱中，13,000rpm离心30s。弃去收集管中的液体，加入600μL洗液，13,000rpm离心30s。重复上一步。弃去收集管中液体，13,000rpm空柱离心2min，以除去残留的洗涤液。将吸附柱移入新的1.5mL离心管中，向柱中央加入洗脱液 50μL，室温静置1min，13000rpm离心30s，离心管中液体即为模板RNA。反转录条件为：42℃ 45min，94℃ 3min；PCR反应条件为：94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 30s，共循环35次，72℃延伸7min。使用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果，结果如图1。

表2 大肠杆菌药敏实验结果单位：mm

由图1结果可见，扩增出明显的条带，与试剂盒里设定的扩增片段大小相符。

4 诊断

图1 RT-PCR扩增结果

根据临床症状、病理变化和实验室检查，诊断为传染性喉气管炎、新城疫和大肠杆菌病混合感染。

5 治疗

针对临床分离到的病原和药敏实验结果，在饮水中添加阿米卡星治疗大肠杆菌感染，肌肉注射新城疫Ⅰ系疫苗[6]，使用传染性喉气管炎弱毒疫苗点眼[7]，同时淘汰处理已发病的病鸡。养殖场加强通风、清扫和消毒工作。经使用治疗方案5天后，鸡群整体精神恢复正常，无死亡。

6 讨论

大肠杆菌为动物体内的一类条件性致病菌[8]，其发生与各种应激因素有关，在卫生条件差、通风不良、饲养管理不当及动物免疫力下降的时候，容易诱发本病[9]，在有其他病原感染后也易继发感染。大肠杆菌对抗菌药物的耐药性非常严重，山西地区鸡源性大肠杆菌对青霉素类、大环内酯类、四环素类和喹诺酮类抗生素耐药性均在50%以上，其中以青霉素类抗生素耐药率最高[10]。这与本例大肠杆菌分离株药敏试验结果相符。表明在山西地区养殖场对药物的使用有所偏好，使得这些药物过量使用，警醒本地区养殖场在疾病治疗过程中注意抗菌药物的交替和轮换使用。

鸡传染性喉气管炎是疱疹病毒感染，只能靠疫苗来预防，弱毒苗目前是使用最多的一类疫苗[11]。本例鸡场发病后使用弱毒疫苗点眼后未发生新的病例，说明疫苗起到保护作用，但弱毒疫苗作为传统防治鸡传染性喉气管炎病的疫苗出现过毒力过强和毒力返强问题[12,13]，所以在使用鸡传染性喉气管炎弱毒苗时要慎重。

本例鸡场此前接种过两次新城疫疫苗，分别为Ⅰ系苗肌注和Ⅳ系苗饮水，此次仍然发病，说明接种疫苗并不能完全抵御疾病发生，疾病的发生还与感染ND病毒毒力强弱以及基因型有关系，但应注意监测及保持较高抗体水平，高抗体水平和整齐度对强毒感染有更高的抵抗力[14]。■

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