ELISA技术在家畜疫病诊断中的应用

2017-03-12李茂宁谢丽华韦达有韦邦伟韦绍婉唐薇薇

中国动物保健 2017年11期

李茂宁，谢丽华＊，韦达有，韦邦伟，韦绍婉，唐薇薇

（1.桂林市动物疫病预防控制中心，广西桂林市，541000；2.梧州市动物疫病预防控制中心，广西梧州市，543002）

ELISA（Enzyme-linked immunosorbent assay，酶联免疫吸附试验）是以酶作为标记物，以抗原和抗体之间免疫结合和显色反应为基础的固相吸附测定方法。该技术具有快速准确、仪器较廉价、适合大批量样品检测等优点，在各领域及各级兽医实验室广泛应用[1，2]。家畜疫病诊断主要内容包括猪牛羊口蹄疫（O 型、I型和 A 型）[3]、猪蓝耳病[4]、猪瘟[5]、猪伪狂犬病[6]、羊小反刍兽疫[7]的抗体检测。本文对ELISA技术在上述家畜疫病诊断中涉及的检测标准、试剂盒选择、影响因素及常见问题进行介绍，供广大实验室技术人员参考。

1 ELISA技术简介

1.1 技术原理

已知抗原与待测抗体（或已知抗体与待测抗原）的结合反应在固相支持物上进行，反应结果的判断以酶与底物作用后的显色反应为标准，显色强度与标本中待测物浓度成正比或反比关系。显色后的有色产物经酶标仪读取OD值来计算和判定结果。

1.2 技术特点

1.2.1 免疫活性抗原与抗体结合形成抗原抗体复合物的过程是一种动态平衡，反应式：Ag（抗原）+Ab（抗体）→Ag·Ab（复合物）。抗原或抗体在体外结合到某种固相载体表面后或解离后，仍然能保持其免疫学活性。

1.2.2 特异性抗原抗体的结合发生在抗原的决定簇与抗体的结合位点之间，化学结构和空间构型互补关系，具有高度的特异性。

1.2.3 敏感性酶具有很高的催化效率，可放大抗原抗体反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感性，一般可以达到μg/mL-ng/mL级。

1.3 基本类型以检测抗体为例，分为三种类型。①间接ELISA：利用酶标记的抗抗体（二抗）检测已与固相抗原结合的待测抗体。②双夹心ELISA：用特异性抗原进行包被和制备酶结合物，以检测相应的抗体。与间接法不同，双夹心法以酶标特异性抗原代替酶标抗抗体。③竞争ELISA：用已知抗原包被酶标板，然后同时加入已知的抗体和待检抗体竞争结合包被的抗原（两个抗体竞争一个抗原）。

2 家畜疫病ELISA诊断方法

口蹄疫（O型、I型和A型）、猪蓝耳病、猪瘟、猪伪狂犬、小反刍兽疫抗体检测均有国际贸易指定或替代方法和国家标准，国内标准分别为GB/T 18935—2003口蹄疫诊断技术、GB/T18090—2008猪繁殖与呼吸综合诊断方法、GB/T16551—2008猪瘟诊断技术、GB/T18641—2002伪狂犬病诊断技术、GB/T 27982—2011小反刍兽疫诊断技术。此外，还有行业标准如NY/T678—2003猪伪狂犬病免疫酶试验方法，或农业部公布的上述病种防治技术规范中的诊断方法如猪瘟防治技术规范猪瘟抗体阻断ELISA检测法。

ELISA酶标板包被的抗原或抗体不同成分，决定了不同用途。口蹄疫结构蛋白VP用于血清型和免疫抗体检测，非结构蛋白NSP用于通用型和感染抗体检测；猪蓝耳病核衣壳蛋白（N蛋白）不能诱导产生病毒中和抗体，不适合用于对疫苗免疫效果监测，而是侧重于PPRSV感染后的早期诊断；猪蓝耳病膜基质蛋白M、糖蛋白GP5用于检测感染或免疫抗体；猪瘟主要包被整个病毒或E2蛋白用于感染与免疫抗体检测；常用猪伪狂犬病疫苗缺失gE基因，因此gE蛋白用于感染性抗体检测，gB蛋白用于免疫抗体检测；小反刍兽疫包被B抗原或N蛋白，用于感染与免疫抗体检测（见表1）。

3 兽医商品化ELISA试剂盒

表1 家畜疫病ELISA诊断方法

一般商品化的ELISA试剂盒组成主要有96孔平底包被板（coated plate）、样品稀释液（dilution buffer）、洗涤液（washing buffer）、酶标记的结合物（conjugate）、显色底物（substrate）、终止液（stop solution）、阳性对照（positive control）、阴性对照（negative control）。有的试剂盒如兰州兽医研究所口蹄疫病毒液相阻断ELISA试剂盒还有病毒抗原，青岛立见小反刍兽疫病毒阻断ELISA抗体检测试剂盒有吐温-20等。

国内各级兽医实验室采用商品化ELISA试剂盒进行家畜疫病诊断，主要生产厂家有兰州兽医研究所、韩国金诺、美国IDEXX、西班牙海博莱、北京天之泰、青岛立见等，不同试剂盒的检测方法、显色系统和读数波长不一致，挑选试剂盒时必须注意其方法与检测标准要求、仪器设备滤光片是否匹配（见表2）。

表2 常用商品化ELISA试剂盒

4 操作步骤和影响因素

4.1 样品前处理

抗体检测需采集动物血液分离血清，溶血的样品因红细胞释放过氧化物酶活性物质和血红蛋白而影响检测结果。标本储存时间过长将形成多聚体进而产生本底过深现象和假阳性的出现。

4.2 试剂回温

实验室温度应控制在18～25℃，从冰箱中取出ELISA试剂盒并打开，使试剂恢复至室温，直至洗涤液结晶完全溶解。该步骤可减少ELISA板孔与孔之间的差异。

4.3 稀释和加样

某些试剂盒（如韩国金诺猪瘟抗体ELISA试剂盒）需要对样品或对照进行稀释，有的试剂盒（如兰州所口蹄疫液相阻断试剂盒）提供的阳性血清已进行过一定倍数稀释，有的不需稀释阳性对照（如IDEXX PRRS X3试剂盒），有的试剂盒（如海博莱猪瘟竞争ELISA试剂盒）不需要样品稀释直接加入ELISA板孔。猪蓝耳病抗体ELISA试剂盒常常需要对样品进行40倍或200倍的稀释，取样量较小，必须准确取样。加样时应加至孔的底部，避免产生气泡。

4.4 孵育

一般分室温孵育（18～25℃）和温箱孵育（37℃）两种，温箱孵育要特别注意封板的密闭性，防止溶液蒸发。ELISA板与板尽量不叠放，避免受热不均。

4.5 洗涤

洗涤是为了清除非特异性干扰物质，加入洗涤液的量一般300μL左右，以满孔但不溢出为宜。每次洗涤均应甩板和拍板，拍板轻重以无液体回流和无气泡为准。拍板后应尽快加液，避免因放置时间过长导致孔内结合物失去生物活性。

4.6 加入酶标结合物

按试剂盒说明稀释或直接加入酶标抗体（蓝色或红色）。

4.7 显色和读数

显色时，需避光，否则TMB、ABTS等显色液易失效。注意显色液有一定致癌性，酸性终止液有腐蚀性。显色后，应在规定时间内终止反应并及时在酶标仪上用规定波长读数。酶标仪读数OD值受读数波长、孔内气泡、孔壁液体、孔底液体斜度影响。

5 免疫抗体监测结果判定

ELISA检测结果常以阳性（+）、阴性（-）、可疑（±）表示。根据2017年国家动物疫病监测与流行病学调查计划，免疫效果评估时，口蹄疫疫苗免疫后（猪28d，其他畜21d后）液相阻断ELISA检测抗体效价≥26为免疫合格。高致病性猪蓝耳病活疫苗免疫28d后ELISA检测抗体阳性判定为免疫合格。猪瘟疫苗免疫21d后抗体阻断ELISA或间接ELISA检测阳性判定为免疫合格。小反刍兽疫活疫苗免疫1～3个月内竞争ELISA或阻断ELISA检测结果为阳性即判定免疫合格。