樱桃谷肉鸭免疫重组禽流感病毒（H5+H7）二价灭活疫苗血清抗体监测报告

宋锋,李峰＊,李玲,张梦梦,姚修杰,卢玉洁,包宇航,苗立中

（1.博兴县畜牧兽医局，山东滨州 25660；2.山东省滨州畜牧兽医研究院,山东滨州 256600；3.山东绿都生物科技有限公司，山东滨州 256600；4.山东畜牧兽医职业学院，山东潍坊 261061）

高致病性禽流感（Highly Pathogenic Avian Influenza,HPAI）发生可对养禽业带来毁灭性打击，疫苗免疫是预防禽流感病毒（AIV）发生、传播的有效手段[1，2]。我国实行了高致病性禽流感强制免疫措施，成效显著。2017年秋季起，我国决定在家禽全面免疫禽流感H5亚型的基础上，全面开展H7N9免疫[3]。鲁北地区是黄河三角洲高效生态农业核心规划区，是山东省乃至全国主要商品肉鸭的生产区。为做好相应的技术指导与服务工作，本实验团队于2017年8-9月，选择部分樱桃谷肉鸭养殖场，进行了重组禽流感病毒（H5+H7）二价灭活疫苗（H5N1 Re-8株+H7N9 H7-Re1株）（以下简称H5+H7二价灭活疫苗）免疫与血清抗体监测工作。

1 材料与方法

1.1 试验鸭群

滨州市某县区5家规模化养殖鸭场，分别标记为A-E，全部采用全进全出养殖模式，养殖规模均为8,000～11,000只。

1.2 H5+H7二价灭活疫苗

政府调拨疫苗，国内某厂家生产，共2个生产批号，分别为170864501，170874501。

1.3 检测试剂

H5亚型（Re-8）、H7亚型血凝抑制抗原与标准阳性血清购自青岛易邦生物工程有限公司；阿氏液、pH值为7.2磷酸盐缓冲液(PBS)由本实验室自行配制。

1.4 试验分组与采样

A、D、E三家养殖场使用生产批号为170864501的疫苗，B、C两家养殖场使用生产批号170874501的疫苗。均在7日龄免疫，免疫剂量为0.5mL/只。各场分别在7日龄、14日龄、21日龄、28日龄、35日龄随机选择26～32只鸭，翅静脉采集血样1mL/只，分离血清后，-40℃保存，统一检测。

1.5 1%鸡红细胞混悬液

采集2～3只SPF公鸡血液，混合后，自行配制。

1.6 检测方法与结果判定

进行微量法[4]血凝（HA）、血凝抑制(HI)试验。以完全抑制4单位抗原的血清最高稀释度作为HI滴度，即血清效价。阴性对照血清HI效价≤2log2，阳性对照血清HI效价误差≤log2时，试验方可成立。HI效价≥4log2判为阳性；HI效价≤3log2判为阴性。

2 结果与分析

2.1 H5N1 Re-8血清抗体检测结果

743份血清样品的H5N1 Re-8抗体检测结果见表1及图1。结果表明：7日龄时，有4个养殖场的平均抗体大于4.5log2；14-21日龄时，其平均抗体水平在 0.35log2～3.05log2，抗体阳性率为 0～42.11%；21日龄后，抗体水平明显上升，至35日龄时有4个养殖场的平均抗体滴度高于4log2，3个养殖场的抗体阳性率高于70%。疫苗免疫后，各个养殖场的抗体数据呈现随日龄增加先下降（至14-21日龄阶段）后上升（21-35日龄阶段）的明显变化；35日龄时，除C养殖场外，其他4个养殖场抗体平均值均高于4log2。但14-28日龄阶段5个养殖场H5N1 Re-8血清抗体的平均值均低于4log2（图1）。

表1 H5N1 Re-8血清抗体的检测结果

图1 不同日龄H5N1 Re-8血清抗体平均值的变化曲线

表2 H7N9血清抗体的检测结果

2.2 H7N9血清抗体检测结果

743份血清样品H7N9抗体检测结果见表2及图2。结果表明：7日龄时，5个养殖场的抗体阳性率均为0；14日龄时，仅有E养殖场的抗体阳性率为73.33%，其他4个养殖场的抗体阳性率均为0；21日龄时，除C养殖场的抗体阳性率为40%低于70%的合格标准外，其他4个养殖场的抗体阳性率均高于70%的合格标准；35日龄时，5个养殖场的抗体阳性率在88.89%-100%之间，全部合格。疫苗免疫后，E养殖场的抗体产生最为迅速，其他4个养殖场在14日龄后才逐渐产生抗体；A、D、E三个养殖场至28日龄后抗体开始下降；B、C两养殖场在28-35日时龄抗体仍处于上升态势（图2）。

2.3 不同批次疫苗免疫后抗体检测结果的比较

2.3.1 两个不同生产批号疫苗免疫后H5N1 Re-8抗体检测统计 结果见表3。应用SPSS 13.0数据统计学分析软件对抗体阳性率、平均抗体滴度两组数据进行TukeyHSD分析。结果显示，p1=p2=1.000；p均大于0.05，差异不显著。但从抗体产生速度、抗体平均值（图3）等方面比较，在H5N1 Re-8免疫效果上，170864501批次要优于170874501批次的疫苗。

2.3.2 两个不同生产批号疫苗免疫后H7N9抗体检测统计 结果见表4。应用SPSS 13.0数据统计学分析软件对抗体阳性率、平均抗体滴度两组数据进行TukeyHSD 分析。结果显示，p3=1.000；p4=0.994，p均大于0.05，差异不显著。从抗体产生速度、平均抗体滴度（图4）比较，在H7N9免疫效果上，170864501批次要优于170874501批次的疫苗。

3 小结与讨论

3.1 禽流感H5N1 Re-8免疫后的抗体消长规律

对检测结果的分析表明，7日龄时检测到的禽流感H5N1Re-8抗体为母源抗体；7-21日龄时母源抗体滴度逐渐降至最低，疫苗免疫后逐渐诱导机体产生了抗体；21日龄后抗体滴度快速提升。疫苗免疫后抗体滴度快速提升大约需要14d，35日龄时有4个养殖场的抗体平均滴度达到4log2，有3个养殖场的达到了70%的抗体阳性率合格标准，但有2-3周的时间处于免疫保护缺失状态。

3.2 禽流感H7N9亚型疫苗免疫后的抗体消长规律

检测结果显示，5个养殖场的商品肉鸭没有检测到H7N9亚型的母源抗体。14日龄时，有1个养殖场的抗体阳性率超过了70%，但其平均抗体滴度为3.6log2，仍低于4log2的合格标准；21日龄时，有4个养殖场的抗体阳性率与平均抗体滴度均达到免疫的合格标准；28-35日龄时，5个养殖场的抗体滴度持续处于较高水平，且抗体阳性率均接近或超过90%，表明H7N9 H7-Re1株疫苗在免疫肉鸭14天后能够产生有效的抗体保护，免疫保护期达到3周以上。

表3 两批次疫苗免疫后H5N1 Re-8抗体的检测结果统计

表4 两批次疫苗免疫后H7N9抗体的检测结果统计

图3 两批次疫苗免疫后H5N1 Re-8抗体的平均值

3.3 H5+H7二价灭活疫苗的免疫探讨

图4 两批次疫苗免疫后H7N9抗体的平均值

3.3.1 免疫H5+H7二价灭活疫苗后的抗体检测结果表明，35日龄时，H5N1 Re-8禽流感亚型疫苗免疫后有4个养殖场的平均抗体滴度高于4log2，3个养殖场的抗体阳性率高于70%；H7N9禽流感亚型疫苗免疫后有5个养殖场的平均抗体滴度高于4log2，5个养殖场的抗体阳性率均高于70%。基本符合宰前免疫抗体水平监测达到70%的标准要求。从两个批次疫苗免疫的效果分析，虽然各个养殖场间在抗体产生速度、抗体滴度水平方面存在批次间的差异，但整体比较来看两个疫苗批次间免疫效果差异不显著（P＞0.05），疫苗质量稳定。

3.3.2 做好防控工作 目前虽然H5+H7二价灭活疫苗虽然列入强制免疫计划，但种禽场免疫后至生产出具有稳定高滴度母源抗体的种卵还需要较长一段时间。其间，商品肉鸭在疫苗免疫前和疫苗免疫后的7-14d，存在母源抗体低下及疫苗抗体产生需要时间的问题，无法有效防护H7N9AIV的感染。因此，必须从加强种禽免疫、切实做好生物安全防护等多方面做好预防控制工作。

3.3.3 分析H5N1 Re-8抗体检测结果 商品肉鸭均具有较高的免疫水平，证明种禽H5N1亚型免疫效果确实。但免疫疫苗后，免疫抗体产生与母源抗体衰减叠加后，有2～3周时间抗体水平较低，存在免疫空白期；一旦感染H5N1亚型，出现疫情的几率和风险较高。

3.3.4 从疫苗选择的角度分析 选择二价疫苗可以减少免疫次数、提高免疫效率；但在两种母源抗体不一致的情况下，科学的选择首免日龄至关重要[5]。另一方面，疫苗制备工艺中不同抗原含量优化，免疫过程中程序优化等需要进一步进行实验研究。

综上所述，建议进一步加强疫苗应用监测与免疫程序试验，广泛开展技术指导服务工作，提醒养殖场户加强生物安全措施，防止疫病发生。同时，基于肉鸭饲养周期短、现行疫苗免疫产生抗体时间长等问题，建议通过有效提升母源抗体的方法来实现商品肉鸭全程被动免疫，达到有效保护的目的。禽流感新型疫苗的研制与合理防控等问题仍亟需解决。■

[1] 王有令,亓丽红,徐怀英,等.樱桃谷肉鸭H5N1亚型禽流感灭活疫苗（Re-6+Re-8）免疫程序研究 [J].中国家禽,2017,39(1)：60-63.

[2] 汪洋,韩焘,姜畔,等.新型甲型H7N9禽流感病毒研究进展[J].中国病毒病杂志,2015,5(1)：67-71.

[3] 中华人民共和国农业部.农业部关于切实做好全国高致病性禽流感秋季免疫工作的通知.农医发[2017]24号.

[4] 中华人民共和国兽药典2015年版.3403红细胞凝集试验法附录28.

[5] 张评浒,任涛,唐应华,等.免疫程序与母源抗体对H5禽流感疫苗免疫鸭和鹅HI抗体水平的影响 [J].中国兽医科技,2005,35(8)：638-642.