组蛋白去乙酰化酶抑制药对损伤和感染性炎性反应中巨噬细胞表型的影响

崇 巍，曾仁庆

专家论坛

组蛋白去乙酰化酶抑制药对损伤和感染性炎性反应中巨噬细胞表型的影响

崇 巍，曾仁庆

组蛋白去乙酰化酶抑制药；表型；损伤；感染

急性百草枯(Paraquat，PQ)中毒及脓毒症均为常见的急危重症。PQ是1,1’-二甲基-4,4’-联吡啶阳离子盐，一种广泛应用的快速灭生性除草剂。急性PQ中毒作为一种急性损伤，主要机制是氧化损伤。组织的氧自由基损伤刺激炎性细胞(如巨噬细胞)分泌各种炎性介质，导致过度炎性反应，从而进一步加重损伤，导致多脏器功能不全，病死率高达50%～70%[1-3]。脓毒症(Sepsis)是感染导致的全身炎性反应[4]。随着人口老龄化、肿瘤发病率及侵入性医疗措施的增加，脓毒症的发病率和死亡率不断的上升，全球每年新增数百万脓毒症患者，其中超过1/4的患者死亡。虽然临床上有许多先进技术等治疗措施，但均不能逆转全身炎性反应及其所带来的严重后果[5,6]。

近年来，巨噬细胞在炎性反应中起主导作用，一直是研究的热点。当病原体侵入机体时，巨噬细胞立即识别并且将其吞噬，并提呈片段化的多肽给T辅助性细胞，同时释放促炎因子与趋化因子摧毁病原体，分泌抗炎因子与趋化因子保护机体。在此过程中，巨噬细胞适应局部微环境进行特异性分化(也称极化)，即M1(促炎)/M2(抗炎)型之间的转换[7]。

在损伤及脓毒症中，M1型巨噬细胞高度表达，大量释放促炎因子，而M2型巨噬细胞表达减少，抗炎因子释放相对减少。因此，促使M1型向M2型巨噬细胞极化可以削弱过度炎性反应。最近研究表明，通过组蛋白乙酰化修饰调节巨噬细胞的极化对炎性疾病的治疗具有潜在价值[8]。笔者对损伤和感染疾病中表观遗传修饰对不同功能表型巨噬细胞的影响进行综述。

1 炎性反应与巨噬细胞表型的关系

巨噬细胞广泛分布于全身各个组织和器官，在炎性反应及内环境稳态中发挥极其重要的作用[9]。巨噬细胞具有高度异质性，通过受体识别入侵病原体并刺激其特定的活化程序，直接或者间接影响基因和蛋白的表达模式来调节细胞的功能特性[10,11]。巨噬细胞的激活具有复杂多样性，主要取决于细胞的状态、组织、炎性因子及病原或损伤相关分子模式[9,12,13]。根据巨噬细胞对不同刺激的反应可分化为M1(促炎)型和M2(抗炎)型，此分化过程称为巨噬细胞的极化。例如，静止状态的巨噬细胞(M0型)，当其膜/核的特异受体(TLR，RIR和NLR)识别入侵的病原体如脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)时，激活M0型细胞促使其向M1型极化，释放大量促炎因子(IL-1β、IL-6、IL-12及TNF-α)，趋化因子(单核细胞趋化蛋白-1(MPC-1)、IL-1)，活性氧(ROS)及诱生型一氧化氮(iNOS)等，同时高度表达组织性复合体(MHC)-Ⅱ类分子和共刺激分子(CD16/32及CD86)，进而触发炎性级联反应[14-17]；当淋巴因子(IL-4、IL-10及1L-13)、转化生长因子-β(TGF-β)或者糖皮质激素诱导M0型向M2型极化时，分泌IL-10及IL-1RA并且抑制IL-1β、IL-12及TNF-α的产生，从而抑制炎性反应，产生与iNOS合成产物NO具有拮抗作用的精氨酸酶-1(Arg-1)，抑制免疫杀伤作用，发挥保护效应，同时表达甘露醇受体(MRC1/CD206)、清道夫受体(SR)、类几丁质酶(YM)、树突状细胞特异性细胞间黏附分子-3结合非整合素(DCSIGN/CD209)、半乳糖型C型凝集素-1(MGL-1)及炎性相关的缺氧诱导有丝分裂因子(FIZZ1)等。此外，M2型巨噬细胞在抑制炎性反应、组织损伤与修复、肿瘤抑制等方面也具有重要作用[18]。

不同表型的巨噬细胞可共存于同一组织，维持内环境的稳态。文献[13]报道巨噬细胞分化和相应基因的转录调控的研究，如M1型的极化涉及许多转录因子的激活，如NF-κB、AP-1、C/EBPb、PU.1 和IRF，STAT6和PPAR-γ参与M2型的极化。因此，转录调控决定炎症基因表达方式及功能。

2 组蛋白去乙酰化酶抑制药对炎性反应的影响

表观遗传学(epigenetics)是指在基因的DNA序列不发生改变的情况下，基因的表达水平与功能发生改变，并产生可遗传表型的遗传现象，而表观遗传机制是直接通过DNA的修饰或者间接通过影响存储DNA的染色体结构调控基因的表达及蛋白质的功能实现[19，20]。下面主要阐述转录后修饰的组蛋白乙酰化的影响。

2.1 组蛋白乙酰化与组蛋白去乙酰化酶抑制药 组蛋白尾N端的乙酰化和去乙酰化是表观遗传机制的重要表现形式，影响染色体的结构，最终调控基因的表达。组蛋白乙酰转移酶(histone acetyltransferase，HAT)和组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase，HDAC)调控组蛋白的乙酰化稳态[21]。HAT促使组蛋白乙酰化，降低DNA与组蛋白的亲和力，继而释放组蛋白尾连接区的DNA，打开压缩的染色体，从而利于转录机器接近目标DNA。反之，HDAC阻碍组蛋白乙酰化使染色质压缩，阻隔转录因子和目标DNA结合，从而抑制相应基因的转录。HAT调节的组蛋白乙酰化和HDAC调节的组蛋白去乙酰化是可逆的动态过程。

真核生物HDAC有18种，分4类：Ⅰ类包括HDACl、HDAC2、HDAC3和HDAC8，Ⅱ类可分为Ⅱa (包括HDAC4、HDAC5、HDAC7及HDAC9)和Ⅱb(包括HDAC6及HDAC10)，Ⅲ类为SIRT(1-7)；Ⅳ类是HDAC11。Ⅰ、Ⅱ和Ⅳ类HDAC是经典的组蛋白去乙酰化酶，依赖Zn2+-金属酶，是目前组蛋白去乙酰化酶抑制药(HDAC inhipitor，HDACi)的主要靶向底物。研究较多的依赖Zn2+-金属酶的HDACi包括：短链脂肪酸类(如VPA抑制Ⅰ及Ⅱa类HDAC)、羟肟酸类【如曲古抑菌素(Trichostatin A，TSA)及辛二酰苯胺异羟肟酸( suberoylanilide hydroxamic acid，SAHA)，抑制Ⅰ、Ⅱ和Ⅳ类HDAC】、环四肽类(如Apicidin及FK228，抑制Ⅰ类HDAC)以及其他类(如MC1568及MC1575，抑制Ⅱa类HDAC等)[22-24]。根据抑制HDAC的特异性可分为非选择性HDACi(如VPA、TSA及SAHA等)与选择性HDACi(如Apicidin及MC1568等)。Ⅲ类是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)依赖酶，不能被Ⅰ、Ⅱ和Ⅳ类HDAC的抑制药抑制。Ⅰ类HDAC广泛分布于各种细胞，主要存在于细胞核内；Ⅱa类HDAC具有组织表达特异性，可在细胞质与细胞核之间转换[25,26]，甚至在线粒体中表达(如HDAC7)[27]。此外，Ⅰ和Ⅱa类HDAC具有不同的催化活性，Ⅰ类HDAC具有很强的去乙酰化酶的活性，而Ⅱa类HDAC酶促反应不活跃，主要是负责大的多分子复合物(包括Ⅰ类HDAC尤其是HDAC3)和其他的调控因子中的蛋白质的招募[28]。

HDACi具有不同的化学结构，能抑制各种HDAC亚型[29]。尽管Ⅱa类HDAC缺乏明显的催化活性，但是HDACi可以通过结合残余的催化位点，影响其构象或者在多分子复合物中影响其他分子间的相互作用，从而抑制Ⅱa类HDAC的功能[30]。HDAC与其他蛋白一样，受乙酰化、磷酸化、泛素化及类泛素化等翻译后修饰的影响，HDACi能调控HDAC本身的乙酰化导致其稳定性及活性的变化[31]。

2.2 HDACi对急性PQ中毒所致炎性反应的影响 PQ是1,1’-二甲基-4,4’-联吡啶阳离子盐，一种广泛应用的快速灭生性除草剂。急性PQ中毒作为一种急性损伤，主要机制是氧化损伤。组织的氧自由基损伤刺激炎性细胞(如巨噬细胞)分泌各种炎性介质，导致过度炎性反应，从而进一步加重损伤，导致多脏器功能不全，病死率高达50%～70%[1-3]。目前尚无特效解毒药物，各种治疗方法疗效均不理想[32]。笔者前期研究发现HDACi SAHA可抑制PQ刺激巨噬细胞产生M1型标志物(ROS与TNF-α)[33]。目前，HDACi在急性PQ中毒方面的应用未见其他报道，这提示HDACi对急性PQ中毒可能具有潜在的治疗价值。

2.3 HDACi对脓毒症所致炎性反应的影响 脓毒症是由感染引起的全身炎性反应综合征[5]。随着人口老龄化、肿瘤发病率及侵入性医疗措施的增加，脓毒症的发病率和死亡率逐年上升。全球每年新增数百万脓毒症患者，其中超过1/4的患者死亡[6]。目前对其没有特效治疗药物，预后极差，虽临床上存在许多先进技术等治疗措施，但也不能逆转全身炎性反应及其所带来的严重后果。HDAC是细胞乙酰化状态的重要调节者，参与免疫细胞(如巨噬细胞)的激活，促炎或者抗炎信号的传导[34]。在分子水平，脓毒症能使蛋白乙酰化水平失衡，导致过度炎性反应，而HDACi能逆转此种变化[35]。研究发现非选择性HDACi (SAHA、TSA及VPA)能减轻LPS刺激鼠的炎性反应[8,35,36]，也能明显抑制LPS刺激巨噬细胞IL-1β、IL-6、和TNF-α等基因和蛋白水平的表达[35,37]，但是非选择性HDACi是通过何种HDAC亚类发挥抗炎效应目前尚不清楚。在脓毒症动物模型中，选择性HDACi TubA能改变血液循环中细胞的成分，提高该动物的生存率[38]，选择性HDACi EX-527[39]和AGK2[40]也能提高该动物的生存率。而选择性HDACi Apicidin和 MC1568在脓毒症方面的应用未见报道。因此，分析非选择性HDACi通过何种HDAC亚类发挥抗炎效应，可能有助于选择更特异及疗效更佳的HDACi用于脓毒症治疗。

3 HDACi对脓毒症巨噬细胞表型的影响

基于非选择性HDACi的抗炎活性及巨噬细胞在炎性反应中调控促炎或者抗炎的作用，非选择性HDACi抑制LPS诱导的炎性反应可能与巨噬细胞促炎(M1)表型极化相关。研究表明非选择性HDACi(VPA及SAHA)能抑制M1型标志物的表达[17,34]，TSA可削弱脓毒症诱导的急性肺损伤的炎性反应及抑制巨噬细胞M1表型极化。McWhorter等[41]研究表明巨噬细胞形态是M1/M2表型的关键标记，而Mariana等[42]研究提示抑制HDAC活性导致巨噬细胞形态的转变[42]。最新研究表明HDAC Ⅱa抑制药促进受损神经细胞存活与生长，而HDAC I类抑制药无此效应[24]，这提示Ⅰ和Ⅱa类HDAC在脓毒症炎性反应中可能具有不同作用，有待进一步研究。

选择性HDACi能抑制PQ及LPS诱导的炎性反应，且选择性HDACi抑制LPS诱导的炎性反应与巨噬细胞M1表型极化相关，但是选择性HDACi通过何种HDAC的亚类发挥的抗炎作用目前尚不十分清楚。Alam研究团队发现TubA(Ⅱb HDACi)，AGK2(Ⅲ类HDACi)和EX-527(Ⅲ类HDACi)能提高脓毒症动物模型的生存率，但特异性抑制Ⅰ或者Ⅱa类的HDACi对脓毒症和急性PQ中毒炎性反应的影响的研究尚未见报道。

[1] Dinisoliveira R J, Duarte J A, Sáncheznavarro A,etal. Paraquat poisonings: mechanisms of lung toxicity, clinical features, and treatment [J]. Critical Reviews in Toxicology, 2008, 38(1):13-71.

[2] Wang X, Luo F, Zhao H. Paraquat-Induced Reactive Oxygen Species Inhibit Neutrophil Apoptosis via a p38 MAPK/NF-κB-IL-6/TNF-α Positive-Feedback Circuit [J]. PloS one, 2014, 9(4): e93837.

[3] 朱文捷, 陈英杰, 吴贤仁. 急性百草枯中毒流行病学调查及预后影响因素分析[J]. 黑龙江医学, 2015, 39(8):925-926.

[4] Singer M, Deutschman C S, Seymour C W,etal.The Third International Consensus Definitions for Sepsis and Septic Shock (Sepsis-3) [J]. JAMA, 2016, 315(8): 801-810.

[5] Russell J A. Management of sepsis [J]. N Engl J Med, 2006, 355(16): 1699-1713.

[6] Angus D C, Van der Poll T. Severe sepsis and septic shock [J]. New England Journal of Medicine, 2013, 369(9): 840-851.

[7] Steinman R M, Idoyaga J. Features of the dendritic cell lineage [J]. Immunological Reviews, 2010, 234(1):5-17.

[8] Thangavel J, Samanta S, Rajasingh S,etal. Epigenetic modifiers reduce inflammation and modulate macrophage phenotype during endotoxemia-induced acute lung injury [J]. J Cell Sci, 2015, 128(16): 3094-3105.

[9] Epelman S, Lavine K J, Randolph G J. Origin and functions of tissue macrophages [J]. Immunity, 2014, 41(1): 21-35.

[10] Takeuchi O, Akira S. Pattern recognition receptors and inflammation [J]. Cell, 2010, 140(6): 805-820.

[11] Gordon S, Martinez F O. Alternative activation of macrophages: mechanism and functions [J]. Immunity, 2010, 32(5): 593-604.

[12] Wynn T A, Vannella K M. Macrophages in Tissue Repair, Regeneration, and Fibrosis [J]. Immunity, 2016, 44(3): 450-462.

[13] Glass C K, Natoli G. Molecular control of activation and priming in macrophages [J]. Nat Immunol, 2016, 17(1): 26-33.

[14] O’neill L A, Golenbock D, Bowie A G. The history of Toll-like receptors-redefining innate immunity[J]. Nat Rev Immunol, 2013, 13(6): 453-460.

[15] Schmitz M L, Weber A, Roxlau T,etal. Signal integration, crosstalk mechanisms and networks in the function of inflammatory cytokines[J]. Biochim Biophys Acta, 2011, 1813(12): 2165-2175.

[16] Chong W, Li Y, Liu B,etal. Histone deacetylase inhibitor suberoylanilide hydroxamic acid attenuates Toll-like receptor 4 signaling in lipopolysaccharide-stimulated mouse macrophages[J]. J Surg Res, 2012, 178(2): 851-859.

[17] Chong W, Li Y, Liu B,etal. Anti-inflammatory properties of histone deacetylase inhibitors: a mechanistic study [J]. J Trauma Acute Care Surg, 2012, 72(2): 347-353; discussion 353-354.

[18] Sindrilaru A, Peters T, Wieschalka S,etal. An unrestrained proinflammatory M1 macrophage population induced by iron impairs wound healing in humans and mice [J]. J Clin Invest, 2011, 121(3): 985-997.

[19] Bernstein B E, Meissner A, Lander E S. The mammalian epigenome[J]. Cell, 2007, 128(4): 669-681.

[20] Kouzarides T. Chromatin modifications and their function [J]. Cell, 2007, 128(4): 693-705.

[21] Gunawardhana L P, Gibson P G, Simpson J L,etal. Activity and expression of histone acetylases and deacetylases in inflammatory phenotypes of asthma[J]. Clin Exp Allergy, 2014, 44(1): 47-57.

[22] Venza I, Visalli M, Oteri R,etal. Class II-specific histone deacetylase inhibitors MC1568 and MC1575 suppress IL-8 expression in human melanoma cells [J]. Pigment Cell Melanoma Res, 2013, 26(2): 193-204.

[23] Halaweish I, Nikolian V, Georgoff P,etal. Creating a “Pro-survival Phenotype” Through Histone Deacetylase Inhibition: Past, Present, and Future [J]. Shock (Augusta, Ga.), 2015, 44(1): 6.

[24] Collins L M, Adriaanse L J, Theratile S D,etal. Class-IIa Histone Deacetylase Inhibition Promotes the Growth of Neural Processes and Protects Them Against Neurotoxic Insult[J]. Mol Neurobiol, 2015,51(3):1432-1442.

[25] Yang X J, Seto E. The Rpd3/Hda1 family of lysine deacetylases: from bacteria and yeast to mice and men [J]. Nat Rev Mol Cell Biol, 2008, 9(3): 206-218.

[26] Haberland M, Montgomery R L, Olson E N. The many roles of histone deacetylases in development and physiology: implications for disease and therapy [J]. Nat Rev Genet, 2009, 10(1): 32-42.

[27] Di Giorgio E, Brancolini C. Regulation of class IIa HDAC activities: it is not only matter of subcellular localization [J]. Epigenetics, 2016, 8(2): 251-269.

[28] Lahm A, Paolini C, Pallaoro M,etal. Unraveling the hidden catalytic activity of vertebrate class IIa histone deacetylases[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2007, 104(44): 17335-17340.

[29] Bantscheff M, Hopf C, Savitski M M,etal. Chemoproteomics profiling of HDAC inhibitors reveals selective targeting of HDAC complexes[J]. Nat Biotechnol, 2011, 29(3): 255-265.

[30] Bottomley M J, Lo Surdo P, Di Giovine P,etal. Structural and functional analysis of the human HDAC4 catalytic domain reveals a regulatory structural zinc-binding domain [J]. J Biol Chem, 2008, 283(39): 26694-26704.

[31] Brandl A, Heinzel T, Kramer O H. Histone deacetylases: salesmen and customers in the post-translational modification market [J]. Biol Cell, 2009, 101(4): 193-205.

[32] 中国医师协会急诊医师分会. 急性百草枯中毒诊治专家共识(2013)[J]. 中国急救医学, 2013, 33(6):484-489.

[33] 陈 瑶,崇 巍,王丹娜,等. 百草枯对巨噬细胞的毒性作用及ROS、IL-6和TNF-α产生的影响[J]. 中国医科大学学报, 2014, 43(12):1105-1108.

[34] Parbin S, Kar S, Shilpi A,etal. Histone deacetylases: a saga of perturbed acetylation homeostasis in cancer [J]. J Histochem Cytochem, 2014, 62(1): 11-33.

[35] Zhao Y, Zhou P, Liu B,etal. Protective effect of suberoylanilide hydroxamic acid against lipopolysaccharide-induced liver damage in rodents[J]. J Surg Res, 2015, 194(2): 544-550.

[36] Ji M H, Li G M, Jia M,etal. Valproic acid attenuates lipopolysaccharide-induced acute lung injury in mice[J]. Inflammation, 2013, 36(6): 1453-1459.

[37] Song R, Yu D, Yoon J,etal. Valproic acid attenuates the expression of pro-inflammatory cytokines lipopolysaccharide-treated canine peripheral blood mononuclear cells (in vitro) and in a canine endotoxemia model (in vivo)[J]. Veterinary immunology and immunopathology, 2015, 166(3): 132-137.

[38] Zhao T, Li Y, Liu B,etal. Selective inhibition of histone deacetylase 6 alters the composition of circulating blood cells in a lethal septic model [J]. J Surg Res, 2014, 190(2): 647-654.

[39] Zhao T, Li Y, Liu B,etal. Histone deacetylase III as a potential therapeutic target for the treatment of lethal sepsis[J]. J Trauma Acute Care Surg, 2014, 77(6): 913-919; discussion 919.

[40] Zhao T, Alam H B, Liu B,etal. Selective Inhibition of SIRT2 Improves Outcomes in a Lethal Septic Model [J]. Curr Mol Med, 2015, 15(7): 634-641.

[41] Mcwhorter F Y, Wang T, Nguyen P,etal. Modulation of macrophage phenotype by cell shape[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2013, 110(43): 17253-17258.

[42] Cabanel M, Brand C, Oliveira-Nunes M C,etal. Epigenetic Control of Macrophage Shape Transition towards an Atypical Elongated Phenotype by Histone Deacetylase Activity[J]. PLoS One, 2015, 10(7): e0132984.

(2017-03-20收稿 2017-05-20修回)

(责任编辑 梁秋野)

R329.28

国家自然基金面上项目(81350120)；辽宁省自然基金面上项目(201602815)；沈阳市科技计划(F15-139-9-24)

崇 巍，教授，主任医师，硕士、博士研究生导师。

110001 沈阳，中国医科大学附属第一医院急诊科