金口宝对兔口腔溃疡模型的影响*

肖瑛琦，陈 琪，苏 松，付文广，谢 鑫，郑思琳△

(西南医科大学:1.附属医院护理部；2.护理学院；3.附属医院肝胆外科；4.附属医院血液内科，四川泸州 646000)

金口宝对兔口腔溃疡模型的影响*

肖瑛琦1,2，陈 琪1，苏 松3，付文广3，谢 鑫4，郑思琳1△

(西南医科大学:1.附属医院护理部；2.护理学院；3.附属医院肝胆外科；4.附属医院血液内科，四川泸州 646000)

目的 探讨金口宝对兔口腔溃疡的治疗效果及其作用机制。方法 在60只实验用SPF级新西兰大白兔中随机抓取6只作为溃疡模型的鉴定，其余随机等分为3组：对照组(NC组)、生理盐水药膜组(NS组)、金口宝药膜组(JK组)。用40%的冰醋酸溶液烧灼兔口腔颊膜复制口腔溃疡模型。观察在造模当天及给药的第3、5、7天兔口腔溃疡的变化情况，利用逆转录PCR检测兔口腔颊部黏膜组织中表皮生长因子(EGF)水平，使用HE染色观察兔口腔溃疡局部病理组织学变化。结果 与NS组比较，在给药的第3、5、7天JK组可以显著减小溃疡面积(P<0.01)。与NC组比较，NS组、JK组兔口腔颊部黏膜组织中EGF水平明显升高(P<0.01)，但JK组EGF水平较NS组升高快，两组比较差异有统计学意义(P<0.01)。在给药的第3、5、7天，兔口腔溃疡HE染色切片显示，JK组较NS组炎症细胞明显减少，成纤维细胞明显增生，上皮增生情况良好。结论 金口宝可以明显改善兔口腔溃疡症状并促进溃疡愈合，金口宝可能是通过调节口腔溃疡时EGF水平而增强口腔溃疡的修复能力。

金口宝；口腔溃疡；表皮生长因子；动物实验

口腔溃疡,又称“口疮”，是发生在口腔黏膜上的表浅性溃疡，大小可以从米粒至黄豆大小，成圆形或卵圆形，溃疡周围充血[1]，局部疼痛，主要发生在唇、颊、舌缘等部位，往往反复发作、久治不愈，给患者带来痛苦，影响患者的工作与生活。目前，治疗口腔溃疡以药物治疗为主，但效果仍不够理想[2]。金口宝是一类由中药(金银花、栀子、白芷、白茅根、桔梗、玉竹、甘草等)精制而成的含片，目前主要用于治疗口腔溃疡、牙周炎等口腔疾患，然而，治疗口腔溃疡的机制尚未明确。因此，本研究通过实验性口腔溃疡兔在应用金口宝药膜后，观察其症状及口腔颊部黏膜组织中表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)的变化，来探讨金口宝治疗口腔溃疡的机制，为金口宝临床用药治疗口腔溃疡提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 选SPF级新西兰兔60只，雌雄各半，体质量3 000～3 500 g，购于泸州医学院实验动物中心[许可证号：SYXK(川)2013-065]，颗粒饲料饲养，保证充足饮水，室温(20±2)℃，平均相对湿度(40～60)%。

1.1.2 实验药品及试剂 羟丙基甲基纤维素购自浙江湖州展望天明有限公司，金口宝含片购自寿世保元食品有限公司，吐温-80购自百世化工有限公司，甘油购自永大化学试剂有限公司，冰乙酸购自金山化学试剂有限公司，First Strand cDNA Synthesis Kit购自博奥森生物技术有限公司，逆转录试剂盒购自博奥森生物技术有限公司，RNA抽提试剂盒购自美国InvitroGen公司，2×TaqPCR MasterMix购自中国天根生化科技有限公司，DNA Master购自日本TaKaRa公司，99%精盐购自SiGma-Aldrich西格玛奥德里奇有限公司。

1.1.3 实验仪器 组织匀浆器购自美国Cole-Parmer公司，自动染色机购自德国Leica公司，病理切片机购自德国Leica公司，光学显微镜购自日本Olympus公司，超低温冰箱购自德国Eppendorf公司，Mini-H3垂直电泳仪购自美国Biorad 公司，紫外凝胶成像分析系统LAS-3000购自日本富士公司，紫外分光光度计ND-1000购自美国NanoDrop公司，高速多功能冷冻离心机购自THERMO公司，超低温冰箱(-80 ℃)购自美国Biorad公司，Maxi-MixII试管震荡器购自美国BarNSGtead/Thermolyne公司，HMIAS-2000高清晰彩色医学图文分析系统购自武汉千屏影像技术有限责任公司。

1.2 方法

1.2.1 药物制备 金口宝药膜的制备：取金口宝含片600 g，吐温-80 5.0 mL，甘油20.0 mL，加饱和羟丙甲基纤维素液至1 000 mL，玻棒搅拌至充分溶解成凝胶状，静置24 h后均匀铺盘，待干后将其切成直径1 cm的药膜贴，紫外线照射消毒，聚乙烯薄膜密封备用。生理盐水药膜的制备：取精盐9 g,加饱和羟丙甲基纤维素液至1 000 mL，其余方法同金口宝药膜。

1.2.2 动物分组 60只实验用SPF级新西南大白兔，将所有兔按照体质量大小进行编号，采用随机数字表的方法在样本兔中随机抽取6只作为溃疡模型的鉴定(模型组)，其余按照相同的方法随机等分为3组：对照组(NC组)，不建立溃疡模型，也不做任何处理；生理盐水药膜组(NS组)，建立溃疡模型，并给予生理盐水药膜治疗；金口宝药膜组(JK组)，建立溃疡模型，并给予金口宝药膜治疗。每组18只(雌雄各半)。

1.2.3 模型制备 用3%的戊巴比妥钠(注射剂量为30 mg/kg[3])将需要建膜的兔麻醉，将直径为8 mm的玻棒(玻棒长度为10 cm)蘸取浓度为40%的冰醋酸置于兔左右两侧距口角2 mm颊膜处烧灼60 s,生理盐水冲洗1 min，使局部成灰白色，直径8 mm的白色损害，24 h后肉眼可见兔口腔颊部充血、红肿，黄或白色假膜覆盖，溃疡模型形成。

1.2.4 给药 模型建立后各组开始给药。NC组、模型组不作处理；NS组用生理盐水药膜贴敷兔口腔溃疡面；JK组用金口宝药膜贴敷兔口腔溃疡面。每天2次(分别在9：00与17：00)，两侧1次均1片药膜，每次5 min，然后以温生理盐水清洗用药局部，连续7 d。

1.2.5 指标观测 (1)兔症状体征变化：兔症状体征请本课题另一名未参与造模和分组成员B(定人)肉眼观察为主。观察指标为兔活动情况、体质量、大小便、毛色、进食等情况的变化。(2)兔溃疡形态变化及面积测定：在建模成功当天(0 d)处死用于溃疡模型鉴定的兔； NC组、NS组、JK组中以随机数字表方法在用药后的第3、5、7天随机处死6只兔。课题组成员B观察兔口腔溃疡的形态，如充血情况，口腔黏膜色泽，有无假膜覆盖等。将处死的各组兔，嘴巴剪开，充分暴露整个口腔，选取口腔黏膜(以溃疡和正常黏膜交界处的组织为宜)[3]，用游标卡尺测量溃疡大小，用Imageconverter软件计算溃疡面积(定人B、定位置、定焦聚照相)。(3)兔口腔颊部黏膜组织中EGF水平的测定：将切取的溃疡病区病理标本，右侧置于10%甲醛溶液固定，常规石蜡包埋，左侧立即液氮速冻，以防mRNA降解，然后送实验室-80 ℃冰箱冻存备用，用RT-PCR方法检测EGF mRNA的表达量，Quantity One软件计算比较RT-PCR产物条带与β-actin条带的光密度的相对比值。(4)兔溃疡局部病理组织学变化：将石蜡包埋的标本切片进行HE染色，观察各组兔口腔溃疡组织形态(NC组取口腔溃疡相应位置的局部组织)。

2 结 果

2.1 各组兔症状体征变化比较 造模前及NC组兔口唇干燥，活动正常，反应灵活，食欲良好，毛色光泽顺滑，小便淡黄，大便正常；造模后口唇边潮湿、偶有流口水，活动减少，精神较差，摄食量饮水量减少，体质量减轻，毛色较之前黯淡粗糙，小便黄且量少，大便减少。JK组经金口宝治疗后逐渐恢复，饮食、饮水增加，体质量逐渐回升，口唇较之前干燥，毛色逐渐光滑，活动逐渐增加，大小便逐渐趋于正常。NS组恢复速度较JK组慢。

2.2 NS、JK组兔溃疡形态及面积变化比较 NC组口腔黏膜光整，色淡红，有光泽。冰醋酸烧灼24 h后，兔口腔颊部形成圆形或椭圆形的溃疡，直径约8 mm，边缘整齐，周边红肿充血，表面有黄色或灰白色假膜覆盖。随着时间推移，口腔黏膜充血水肿逐渐减轻，逐渐恢复光泽，JK组恢复情况较NS组好。在建模成功第1天JK组溃疡面积与NS组比较差异无统计学意义(P>0.05)；在用药的第3、5、7天，JK组溃疡面积明显小于NS组(P<0.05)，见表1。

表1 NS、JK组兔不同时间溃疡面积比较

a：P<0.05，与NS组比较。

2.3 各组兔口腔颊部黏膜组织中EGF水平比较 EGF mRNA在NC组中少量表达，与NS、JK组比较，差异有统计学意义(P<0．05)，NS组与JK组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。在用药后第3、5、7天，NS组、JK组中EGF的表达水平逐渐升高，各组比较差异有统计学意义(P<0.01)，见表2、图1。

表2 各组兔口腔黏膜EGF mRNA水平比较

a：P<0.05，与NC组比较；b：P<0.05，与NS组比较。

图1 口腔黏膜EGF mRNA表达

2.4 光镜观察兔颊黏膜病理组织学变化 细胞核呈蓝色，细胞质呈淡红色。NC组兔口腔黏膜上皮完整覆盖，下方是由致密结缔组织组成的固有层，未见明显炎性细胞浸润。NS、JK组兔用药3 d后，黏膜上皮细胞坏死脱落，NS组炎症细胞数目较多，几乎看不到新生的成纤维细胞；JK组炎症细胞数目明显减少，有少量新生的成纤维细胞。用药5 d后，NS组炎症细胞数目开始减少；JK组炎症细胞数目不断减少，可以看到许多新生的成纤维细胞。用药7 d后，NS组炎症细胞数目明显减轻,且有许多新生的成纤维细胞；JK组表面几乎被黏膜上皮覆盖，溃疡在趋于愈合，见图2。

A：模型组0 d；B：NC组1 d；C：NS组用药3 d；D：JK组用药3 d；E：NS组用药5 d；F：JK组用药5 d；G：NS组用药7 d；H：JK组用药7 d。

图2 各组兔颊黏膜HE染色(×200)

3 讨 论

近年来，口腔溃荡的发病率呈现逐年升高的趋势，可发生于任何年龄，但以青壮年为多[1],溃疡发生时，口腔黏膜上皮结构消失，被大量炎性细胞浸润，表皮细胞发生上皮破坏脱落，局部疼痛，当遇到酸、咸、热、辣等刺激时疼痛加重，给患者带来困扰。目前，用于治疗口腔溃疡的药品种类繁多，多是对症治疗或者采用增强免疫的药物[4]。随着中医的发展，中药临床治疗一些疾病的疗效得到了较为广泛的认可。中医认为口腔溃疡的发生与“火”相关，据“火”之虚实，可首分为虚实，实证常见脾胃伏火、心火上炎、心脾积热、脾虚湿困；虚证常见阴虚火旺、脾肾虚弱[4]。

金口宝是一类由中药(金银花、栀子、白芷、白茅根、桔梗、玉竹、甘草等)精制而成的含片。金银花味甘微苦，性寒，善清利上焦和肌表之毒邪；此外，金银花因其含绿原酸类、黄酮类化合物及挥发油等成分，具有抗炎、抑制多种病原菌、抗病毒、发挥免疫调节等作用[5]。栀子，味苦性寒，归心、肝、肺、胃、三焦经，有泻火除烦、清热利湿、凉血解毒的功效[6]。白芷味辛微苦，性温，气芳香，有祛风湿，活血排脓，生肌止痛的功效[7]。白茅根凉血止血，消肿利尿，清热解毒[8]。桔梗能宣肺泄邪以利咽开音；性散上行，能利肺气以排壅肺之脓痰，镇咳、解热，还有镇静，镇痛，降血糖，降胆固醇，增强抗炎和免疫的作用[9]。玉竹味甘，性微寒，入肺、胃经，具有养阴、润燥、除烦、止渴的功效[10]。甘草味甘，性平，归十二经，补脾益气，滋咳润肺，缓急解毒，能调和百药[11]。综观金口宝配方，既有泻火清热的治本之功，又有止痛、滋阴、除烦的治标之效。

本研究显示金口宝可以有效改善实验性口腔溃疡兔的体征，缓解局部组织的炎症反应，减少渗出，促进溃疡面的快速恢复，缩短溃疡时间。EGF具有诱导细胞生长和增殖的作用[12]。有研究表明，在口腔黏膜的保护屏障中EGF起着重要的作用，为口腔黏膜上皮细胞的生长、分化和增殖提供基础[13]，尤其与黏膜基底细胞增殖的关系更为密切[14]。口腔溃疡的患者常会出现EGF的短缺，这造成了口腔溃疡的迁延不愈[15]。本研究显示，造模成功当天，EGF mRNA在NC组中少量表达(0.23±0.03)，较NS、JK组(0.44±0.03)少，差异有统计学意义(P<0.05)，NS组与JK组比较，差异无统计学意义(P>0.05)，提示EGF mRNA的表达在溃疡出现时随即增加。在用药的第3、5、7天，NS组与JK组EGF mRNA的表达差异均有统计学意义(P<0.05),说明金口宝能够增强口腔黏膜EGF mRNA基因的表达，促进EGF的分泌；且随着时间的推移，EGF mRNA的表达量逐渐增多，提示EGF参与了口腔溃疡愈合的过程。有研究表明，在溃疡患者口腔黏膜中EGF分泌减少，使口腔溃疡的恢复受到阻碍[16]。因此，可以认为金口宝通过促进口腔黏膜中EGF的分泌，提高了口腔溃疡自我修复的能力，促进溃疡面愈合。

本研究通过观察实验性口腔溃疡兔的症状体征、溃疡形态面积、病理变化、EGF的分泌情况，对3组兔口腔溃疡恢复情况进行观察比较，表明金口宝能够提高口腔黏膜细胞的自我修护能力，缩短溃疡时间，加速溃疡面愈合，其作用机制可能与促进EGF的分泌有关，为金口宝的临床用药提供了实验依据与基础数据。

[1]刘丹丹,白明,闫欣,等.细辛醋糊外用对豚鼠口腔溃疡模型的影响[J].中华中医药杂志,2012,27(2):334-337.

[2]Aoun N,Ehajj G,El TS.Oral ulcer:an uncommon site in primary tuberculosis[J].Aust Dent J,2015,60(1):119-122.

[3]李常伟.骨骼肌生物电阻抗与组织生物活性相关性的初步研究[D].河北:河北医科大学,2012.

[4]龙惠珍,殷洁,夏永良.补中益气汤对脾虚型复发性口腔溃疡小鼠IL-2 IFN-Y表达的影响[J].中华中医药学刊,2010,28(3):523-525.

[5]王芳,蒋跃平,王晓良,等.金银花的化学成分研究[J].中国中药杂志,2013,38(9):1378-1385.

[6]孟祥乐,李红伟,李颜,等.栀子化学成分及其药理作用研究进展[J].中国新药杂志,2011,20(11):959-967.

[7]朱艺欣,李宝莉,马宏胜,等.白芷的有效成分提取、药理作用及临床应用研究进展[J].中国医药导报,2014,11(31):159-166.

[8]国家药典委员会.中华人民共和国药典：2000年版[M].北京:化学工业出版社,2005:70.

[9]李婷,徐文珊,李西文,等.中药桔梗的现代药理研究进展[J].中药药理与临床,2013,29(2):205-208.

[10]王强,李盛钰,杨帆,等.玉竹中性多糖的分离纯化及单糖组成分析[J].食品科学,2010,31(15):100-102.

[11]刘洋洋,刘春生,曾斌芳,等.甘草种质资源研究进展[J].中草药,2013,44(24):3593-3598.

[12]Damevska K,Gocev G,Nikolovska S.Eosinophilic ulcer of the oral mucosa:report of a case with multiple synchronous lesions[J].Am J Dermatopathol,2014,36(7):594-596.

[13]Song H,Lim H,Das SK,et al.Dysregulation of EGF family of growth factors and COX-2 in the uterus during the preattachment and attachment reactions of the blastocyst with the luminal epithelium correlates with implantation failure in LIF- Deficient mice[J].Mol Endocrinol,2000,14(8):1147-1161.

[14]王汉明,朱晓密,赵雅君.口疮1号方治疗大鼠口腔溃疡的实验研究[J].口腔医学研究,2014,30(7):627-629.

[15]Arkhipov A,Shan Y,Das R,et al.Architecture and membrane interactions of the EGF receptor[J].Cell,2013,152(3):557-569.

[16]Tomas A,Futter CE,Eden ER.EGF receptor trafficking:consequences for signaling and cancer[J].Trends Cell Biol,2014,24(1):26-34.

Effect of Jinkoubao on rabbit oral ulcer model*

XiaoYingqi1，2,ChenQi1,SuSong3,FuWenguang3,XieXin4,ZhengSilin1△

(1.DepartmentofNursing,AffiliatedHospitalofSouthwestMedicalUniversity,Luzhou,Sichuan646000,China; 2.NursingCollege,SouthwestMedicalUniversity,Luzhou,Sichuan646000,China;3.DepartmentofHepatobiliarySurgery,AffiliatedHospitalofSouthwestMedicalUniversity,Luzhou,Sichuan646000,China; 4.DepartmentofHematoloyg,AffiliatedHospitalofSouthwestMedicalUniversity,Luzhou,Sichuan646000,China)

Objective To explore the therapeutic effect of Jinkoubao on oral ulcer in rabbits and its action mechanism.Methods Among 60 SPF New Zealand rabbits,6 cases were randomly selected for the ulcer model identification,and the rest was randomly and equally divided into 3 groups:the control group (NC group),normal saline drug film group (NS group) and Jinkoubao film group (JK group).The rabbit model of oral ulcer was constructed by applying 40% glacial acetic acid to burn rabbit oral mucosa for duplicating the oral ulcer model.of the change situation of oral ulcer was observed on the same day for constructing model,on 3,5,7 d after medication.The EGF level in oral mucosal tissue was detected by using RT-PCR and the local histopathological changes in oral ulcer was observed by using HE staining method.Results Compared with the NS group,the ulcer area on 3,5,7 d after medication in the JK group was significantly deceased (P<0.01).Compared with the NS group,the EGF level in oral buccal mucosal tissue in the NS group and JK group was markedly increased (P<0.01).But the EGF level increase in the JK group was faster than that in the NS group,the difference was statistically significant(P<0.01).The HE staining section of rabbit oral ulcer on 3,5,7 d after medication showed that the inflammatory cells decrease in the JK group was more obvious than that in the NS group,fibroblasts proliferation was obvious and epithelial hyperplasia was good.Conclusion Jinkoubao could greatly improve the symptoms of oral ulcer in rabbits and promotes its healing,which is possible to strengthen the repair capacity of oral ulcer by regulating the EGF level.

Jinkoubao;oral ulcer;epidermal growth factor;animal experimentation

��·基础研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.07.007

四川省科技厅(苗子工程)资助项目[川科发计(2014)10号]。 作者简介：肖瑛琦(1991-)，在读硕士研究生，主要从事临床护理及护理教育研究。△

，E-mail：zhengsilin@yahoo.cn。

R285.5

A

1671-8348(2017)07-0886-03

2016-08-22

2016-11-05)