密度梯度离心联合传代贴壁法分离、培养兔骨髓间充质干细胞

丁 冬，闫 鑫，李晓亮，张博闻，董梦婷，温 鹏，姚占川，黄永禄，杨子洋，赵 飞

·论 著·

密度梯度离心联合传代贴壁法分离、培养兔骨髓间充质干细胞

丁 冬1，闫 鑫2，李晓亮1，张博闻1，董梦婷2，温 鹏1，姚占川1，黄永禄1，杨子洋1，赵 飞1

目的探讨密度梯度离心联合传代贴壁法分离、培养兔骨髓间充质干细胞的可行性。方法应用密度梯度离心联合传代贴壁法分离、培养兔骨髓间充质干细胞，观察细胞形态变化，应用免疫荧光法鉴定细胞并计算纯度，应用八肽胆囊收缩素(CCK-8)法绘制细胞生长曲线。结果应用密度梯度离心联合传代贴壁法可以分离、培养兔骨髓间充质干细胞，第3代细胞接种后2～8 d进入细胞增殖对数期，兔骨髓间充质干细胞的纯度可达(81.77±2.10)%，3代细胞纯度组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论应用密度梯度离心联合传代贴壁法可以分离、培养并获取正常活性及理想纯度的兔骨髓间充质干细胞。

骨髓间充质干细胞；密度梯度离心法；传代贴壁法；细胞增殖

基质干细胞(MSCs)是一类具有多向分化潜能的干细胞，最初在骨髓中分离所得，即骨髓间充质干细胞(BMMSCs)。BMMSCs被视为一种良好的种子细胞，在成骨、成血管等研究领域得到广泛的应用[1-3]。目前常用的BMMSCs的分离方法有4种，

包括密度梯度离心法、差速贴壁法、流式细胞仪法、免疫吸附法，本研究拟通过密度梯度离心联合差速贴壁法分离、培养兔BMMSCs，观察细胞的形态特点、纯度及增殖活性。

1 材料与方法

1.1 材料：清洁级3月龄大耳白兔3只，由宁夏医科大学实验动物中心提供，动物许可证号：SYXK(宁)2015-0003；DMEM/F12培养基、胰蛋白酶(德国Sigma公司)；淋巴细胞分离液(上海华美公司)；胎牛血清、D-Hanks液(美国Hyclone公司)；CCK-8(北京中杉金桥生物技术有限公司)；高速离心机(Beckman 公司)；荧光显微镜(Zeiss 公司)；倒置相差显微镜(Olympus公司)；5% CO2恒温(37 ℃) 培养箱(Hereaeus)；层流超净工作台(苏州苏净仪器设备有限公司)；酶标仪(美国宝特公司)。

1.2 方法

1.2.1 BMMSCs的原代培养：16号骨髓穿刺针接10 mL注射器，注射器内含0.5 mL稀释的2 500 U/mL的肝素钠，于成年大耳白兔胫骨结节外侧穿刺，抽取骨髓液4 mL，分装后各加入4 mL含10%FBS的DMEM培养液稀释，1 000 r/min离心20 min，弃上清。细胞重悬后移入另一含2倍体积、密度为1.077 g/mL淋巴细胞分离液的无菌离心管中，以2 000 r/min离心20 min，吸取上层与中层间的乳白层，再次稀释，以1 000 r/min离心5 min，弃上清。细胞重悬后计数，以1×106/mL接种于25 mL培养瓶中，加入含10%FBS的DMEM液中培养，5 mL/瓶，37 ℃、5% CO2、饱和湿度下静止培养。接种后5 d首次换液，去除未贴壁的细胞，后每2 d换液1次。

1.2.2 BMMSCs的传代培养：细胞贴壁达到80%时,倒掉陈旧的培养基，D-Hanks液漂洗1次，加入0.25%胰蛋白酶2 mL在培养箱内消化6 min。消化完毕后加入含10%FBS 的DMEM/F12培养液终止消化3 min，轻轻吹打后转入10 mL离心管内，1 200 r/min离心5 min。弃上清，于细胞沉淀中加入细胞培养液吹打混匀，按1∶2传代，置于温度37 ℃、体积分数为5%的CO2饱和湿度培养箱内培养。倒置显微镜下逐日观察细胞形态，当细胞铺满瓶底时重复操作，反复传代扩增。

1.2.3 BMMSCs的纯度鉴定：将传代的BMMSCs按照浓度为1×106/mL接种于24孔细胞培养板中进行培养，培养板预先放置盖玻片；当细胞贴壁达到盖玻片80%时，去除培养基，加入4%多聚甲醛(1 mL/孔)，固定30 min。固定后加PBS在摇床上冲洗3遍，5 min/遍；每孔中加入10%山羊血清200 μl封闭2 h，封闭后吸出山羊血清，勿冲洗；加入一抗(羊抗兔CD 44抗体，1∶300 200 μl/孔)，置于4℃冰箱内孵育24 h，加PBS在摇床上冲洗3遍，5 min/遍；加二抗(FITC标记的驴抗羊，1∶300，200μl/孔)，置于37 ℃温箱内避光孵育4 h，加PBS在摇床上冲洗3遍，5 min/遍；染色细胞核，加入Hochest 33342(1∶200，200μl/孔)，室温静置10 min后，PBS冲洗3遍，5 min/遍，并吹干；取出24孔细胞培养板中的盖玻片，向载玻片上加50 μl防淬灭剂(体积分数为50%的甘油)，将盖玻片细胞贴壁的一面盖在载玻片上；每张片子随机取10个视野，镜下观察并进行纯度分析。

1.2.4 BMMSCs的增殖活性检测：将传代后的BMMSCs接种在96孔细胞培养板内，每孔接种4 000个细胞，加入100 μl培养基，从消化后接种到培养板内开始计时，采用CCK-8法测定各代次BMMSCs第1～14天的细胞增殖活性。

2 结果

2.1 BMMSCs形态学观察：刚分离培养的BMMSCs呈圆形或椭圆形，折光性强，亮度高；之后部分细胞开始贴壁，呈圆形；贴壁的BMMSCs开始增加，伸出伪足，呈短棒状，细胞数目增多，形成不同大小、分散的细胞集落，细胞多呈梭形；细胞继续增殖，集落中细胞数目增多，其中部分BMMSCs可见粗大突起形成，呈三角形、扇形或多角形，部分细胞仍呈长梭形；后期集落细胞数目显著增加，呈放射状向周围扩张，见图1-图6(目录后)。

2.2 BMMSCs的CD44表达情况：免疫组织化学检测原代培养的BMMSCs及第2、3代BMMSCs表面CD44表达情况，阳性率分别为(48.23 ±1.20)%、(69.54 ±2.72)%、(81.77±2.10)%，组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。

2.3 BMMSCs的增殖活性检测：原代培养的BMMSCs，接种后1～4 d为细胞增殖潜伏期，4～9 d进入细胞增殖对数期，之后细胞生长缓慢，进入平台期；第2、3代BMMSCs，细胞增殖的潜伏期相对缩短，对数期较原代细胞提前，之后细胞进入平台期，呈S形生长，符合正常细胞的生长特征。

3 讨论

BMMSCs具有多向分化潜能，被视为组织工程中良好的种子细胞。但BMMSCs在骨髓中的含量少，从动物骨髓中分离BMMSCs的技术难度限制了许多研究的开展，体外分离培养高纯度、生物特性均一的BMMSCs仍是该研究领域的热点。目前分离、培养BMMSCs的方法主要包括密度梯度离心法、流式细胞仪法和免疫磁珠分选法[4-5]，这些方法均有报道从骨髓中分离BMMSCs，但各有利弊，尚未确定一种最佳方案。其中全骨髓贴壁法操作简便，节省经费，但是BMMSCs纯度略低，实验研究中容易受到其他因素的干扰。免疫磁珠分选法较其他方法成本较高，而且至今尚未发现BMMSCs特有的标记分子，并且经过流式细胞仪进行细胞分选时，对细胞的生物活性干扰较大，因此这两种方法仍在探索研究。本实验采用了密度梯度离心联合传代贴壁法对兔BMMSCs进行分离、培养，结果证实应用该方法可以分离、培养兔骨髓间充质干细胞，第3代细胞接种后2～8 d进入细胞增殖对数期，兔骨髓间充质干细胞的纯度可达(81.77±2.10)%，3代细胞纯度组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。密度梯度离心法是根据骨髓中各种细胞的相对密度不同，而离心后各种细胞呈不同梯度分布；差速贴壁法则是利用BMMSCs较其他细胞对胰蛋白酶的敏感性强，能够最先脱落，通过反复传代，达到纯化细胞的目的。实验证实，该纯化方法操作简单，在保证纯化效果的同时，节省经费，对细胞生物活性干预小。

目前尚未发现BMMSCs表面的特异性抗原，它除了具有间质细胞的表面抗原特征外，还具有其他细胞，如内皮细胞、上皮细胞、肌细胞等的表面抗原，所以目前对BMMSCs的鉴定缺乏统一的标准。目前研究人员主要根据BMMSCs的生物学特点进行鉴定[6]，如细胞具有较强的自我更新能力；BMMSCs阳性表达的表面抗原包括CD44、CD29、CD90、CD105，阴性表达主要为造血细胞表面抗原，包括CD34、CD38、CD45；细胞具有多向分化能力，通过鉴定细胞的成骨或成脂水平来反向印证BMMSCs。本实验中，应用免疫荧光法对BMMSCs的表面抗原CD44进行染色鉴定细胞，证实第3代BMMSCs的纯度为(81.77±2.10)%，但因实验条件有限，未对其他表面标记物进行鉴定，在一定程度上不能准确反映细胞的实际纯度，这也将是今后研究工作中克服的重点。

随着研究的深入，BMMSCs的分化潜能远远超出人们的预计[7]。王闯建等[8]采用BMMSCs复合包芯结构骨支架修复兔桡骨缺损取得了一定的效果。Kakabadze A等[9-11]在皮瓣移植应用BmMSCs方面做了初步尝试，为促进缺血皮瓣血管新生及血供重建的研究及临床治疗提供了新的思路和方法。但是目前对BMMSCs促进损伤组织修复的具体机理尚不完全清楚，其安全性及有效性仍有待进一步研究，因而BMMSCs移植治疗尚未广泛应用于临床。

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[2] Hu M，Ludlow D，Alexander JS，et al.Improved wound healing of postischemic cutaneous flaps with the use of bone marrow-derived stem cells[J].Laryngoscope，2014，124(3):642-648.

[3] Rodriguez Lorenzo A，Arufe MC，De La Fuente A，et al.Influence of flap prefabrication on seeding of subcutaneously injected mesenchymal stem cells in microvascular Beds in rats[J].Annals of Plastic Surgery，2014，73(2):234-238.

[4] 李晓峰，赵劲民，苏伟，等.大鼠骨髓间充质干细胞的培养与鉴定[J].中国组织工程研究与临床康复，2011，15(10)：1721-1725.

[5] Ghilzon R，Mcculloch CA，Zohar R.Stromal mesenchymal progenitor cells[J].Leukemia & Lymphoma，1999，32(3/4):211-221.

[6] 祝旭龙，颜谭，姚维杰，等.大鼠骨髓间充质干细胞的分离与培养方法优化[J].南方医科大学学报，2014，34(11)：1621-1626，1631.

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[8] 王闯建，张春霖，吴学建，等.包芯结构骨支架修复兔桡骨缺损[J].外科杂志，2014，31(3)：613-615.

[9] Kakabadze A，Mardaleishvili K，Loladze G，et al.Reconstruction of mandibular defects with autogenous bone and decellularized bovine bone grafts with freeze-dried bone marrow stem cell paracrine factors[J].Oncology Letters，2017，13(3):1811-1818.

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[11] Paknejad M，Eslaminejad MB，Ghaedi B，et al.Isolation and assessment of mesenchymal stem cells derived from bone marrow:histologic and histomorphometric study in a canine periodontal defect[J].Journal of Oral Implantology，2015，41(3):284-291.

2017-06-21责任编辑李 洁

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IsolationandculturerabbitBMMSCsbydensitygradientcentrifugationcombinedwithpassageadherencemethod

DingDong1,YANXin2,LIXiaoliang1,ZHANGBowen1,DONGMengting2,WENPeng1,YAOZhanchuan1,HUANGYonglu1,YANGZiyang1,ZHAOFei1.

1.Hand&Foot&ReconstructionMicrosurgery,NingxiaPeople’sHospital,Yinchuan750002,China;2.ClinicalMedicalCollege,NingxiaPeople’sHospital,Yinchuan750002,China

ZHAOFei,Email: 88652588@qq.com

ObjectiveTo explore the method of isolation and culture rabbit BMMSCs by density-gradients centrifuge and passages adherence culture.MethodsThe changes in cell morphology were observed, the BMMSCs was identified and the purity was calculated by immumofluorescence,and the growth curve of the cell was draw by CCK-8 method.ResultsIt was possible to isolate and culture rabbit BMMSCs by density-gradients centrifuge and passages adherence culture,the 3rd generation cells entered the cell’s log period during the 2nd to 8th day after inoculation,the BMMSCs purity was (81.77±2.10)%,the difference between the three generations of cell purity were statistically significant (P<0.05).ConclusionIt is possible to isolation and culture rabbit BMMSCs by density-gradients centrifuge and passages adherence culture method,the BMMSCs’ activity and purity is desired.

Bonemarrowmesenchymalcell;Densitygradientcentrifuge;Passagesadherence;Cellproliferation

R34

A

10.13621/j.1001-5949.2017.11.0977

西北民族大学2016年中央高校基本科研业务费专项资金项目(31920160099)；2016年宁夏自然科学基金项目(NZ16177，NZ17198)

1.西北民族大学第一附属医院手足和重建显微外科，宁夏 银川 750002

2.西北民族大学第一附属医院临床医学院,宁夏 银川 750002

丁冬(1987-)，男，回族，山东籍，硕士研究生，医师，从事血管、神经等软组织损伤及修复研究。

赵飞，Email:88652588@qq.com

http://kns.cnki.net/kcms/detail/64.1008.R.20171109.1542.020.html