小鼠类风湿性关节炎模型中Th9的极化

韩晓芳

（内蒙古自治区人民医院检验科，内蒙古 呼和浩特 010017）

Th9细胞与其分泌的细胞因子在自身免疫性疾病病程中发挥重要作用。本文拟利用ICOS转基因小鼠及其对照小鼠作为RA模型，初步探讨共刺激信号ICOS调控Th9在类风湿性关节炎中的作用，为后续RA的相关研究提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 试剂

Anti-mouse CD4 FITC，anti-mouse IL-9 PE，anti-mouse ICOS （CD278）PE等流式抗体均购买自eBioscience公司；RPMI1640、PMA、BFA购自美国Sigma公司；IL-9sandwich ELISA 试剂盒购买自eBioscience公司。

1.2 实验方法

1.2.1 动物模型的建立

RA小鼠模型的制备

ICOS转基因小鼠、对照小鼠各30只，后进行如下操作：

（1）胶原-佐剂混合乳剂的配制

①将牛Ⅱ型胶原溶于0.1 M冰醋酸溶液中，浓度为2 mg/mL，4℃过夜；②在无菌的条件下，用1 mL的注射器吸取牛Ⅱ型胶原，置于一洁净的器皿中；③用1 mL的注射器吸取等量佐剂，置于含牛Ⅱ型胶原的洁净器皿中；④用注射器来回推拉，使牛Ⅱ型胶原和佐剂充分混匀，至液体呈乳白色。整个操作过程均在冰上进行，以防止胶原变形。

（2）类风湿性关节炎小鼠模型的制备

每只实验小鼠背部取4-6点进行皮下注射，总共200µl胶原-完全弗氏佐剂混合乳剂，三周后，用同样的方法将不完全弗氏佐剂与牛Ⅱ型胶原乙酸溶液等量混合并乳化，于每只小鼠尾根部取3-5点进行皮下注射，总共100µl，进行加强免疫。

1.2.2 流式细胞仪检测Tfh/Th9细胞群比例

制备小鼠脾淋巴细胞悬液，用0.01MPBS洗2次，每个流式管内加入细胞术为1×106个。以下操作均在冰上，检测CD3+CD8-IL9+标记的Th9细胞，避光4℃孵育30 min后，冰冻PBS离心（300～400 g）洗涤3次，弃上清，重悬细胞，流式送检，用Flowjo7.6软件分析。

1.2.3 脾细胞培养上清中细胞因子的检测

采用ELISA双抗夹心法测定并观察IL-9细胞因子在小鼠不同病期脾淋巴细胞培养上清中表达水平动态变化。

1.3 统计学方法

采用GraphpadPrism5.0统计学软件（CA公司，美国）对数据进行处理。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 ICOS转基因小鼠不同病期脾细胞中Th9细胞群的表达特征

RA小鼠脾细胞中Th9细胞群从6周到12周逐渐上升，ICOS转基因RA小鼠脾细胞Th9亚群比例在6周和12周均明显高于野生型小鼠（6w：4.94+1.42vs2.45+1.09）（12w：13.85+3.32vs8.93+2.56，P＜0.05）。

2.2 ICOS转基因RA小鼠不同病期脾淋巴细胞培养上清IL-9检测

RA小鼠脾细胞培养上清中IL-9表达从6周到12周逐渐上升，ICOS转基因RA小鼠IL-9的表达在6周和12周均明显高于野生型小鼠（6w：6.15+1.63vs2.41+0.96；12w：10.76+2.16vs7.86+1.77，P＜0.05）。

3 讨 论

本研究发现，RA小鼠随着病情的进展，Th9的表达率增多，并且ICOS转基因RA小鼠外周血Th9较正常对照表达明显升高，推测可能是RA发病的重要原因，而ICOS在其中发挥了重要作用。此外，脾细胞培养上清中IL-9的表达经ELISA检测的结果提示，ICOS转基因RA小鼠的IL-9的表达水平较对照组上调。进一步提示，ICOS参与了Th9的炎症效应。

目前Th9细胞被认为是最重要的诱导类风湿关节炎等自身免疫性疾病发生发展的效应T细胞亚群[1-2]，同时区别于Th1、Th2、Th17及Trey，但是又有很多相关联的机制，在很多种自身免疫性疾病发病的机制有待于进一步研究[3]，本实验的结论提示RA等免疫失调的疾病与Th9细胞的异常增多或者细胞相关的效应分子的异常表达是有联系的，故将Th9细胞的相关分子作为靶点下调有望为免疫性疾病的治疗提供新的机遇。

[1] 康 霞.ICOS+Treg细胞和B10细胞在类风湿关节炎发病中的作用及作用机制研究[D].南方医科大学,2014.

[2] 张 娜.黄芪糖蛋白干预胶原诱导性关节炎小鼠T细胞免疫应答的实验研究[D].北京中医药大学,2016.