RP-HPLC法测定黔产大接骨丹根皮药材中紫丁香苷的含量

韩忠耀 李 燕 李方方 陆廷祥 杨树祥 魏学军*

1.黔南民族医学高等专科学校，贵州 都匀 558000；2.河南省上蔡县人民医院，河南 上蔡 463800

RP-HPLC法测定黔产大接骨丹根皮药材中紫丁香苷的含量

韩忠耀1李 燕1李方方2陆廷祥1杨树祥1魏学军1*

1.黔南民族医学高等专科学校，贵州 都匀 558000；2.河南省上蔡县人民医院，河南 上蔡 463800

目的：采用高效液相色谱法测定黔产大接骨丹根皮药材中紫丁香苷的含量，为其质量控制提供依据。方法：采用Agela Promosil C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)，以乙腈-0.5%磷酸水为流动相进行梯度洗脱，流速为1.0mL/min，柱温为35℃，检测波长为220nm，分析时间为65 min，对16批黔产大接骨丹根皮药材中紫丁香苷进行了含量测定。结果：紫丁香苷在0.2881～2.8805μg(r=0.9995)范围内与峰面积呈良好的线性关系；平均加样回收率(n=6)为100.53%，RSD为1.68%。结论：该方法简便、快速、准确，可为大接骨丹根皮药材的质量控制提供参考。

大接骨丹；高效液相色谱法；紫丁香苷；质量控制

大接骨丹为山茱萸科鞘柄木属植物齿裂鞘柄木ToricelliaAngulataOliv.var.intermedia(Harms) Hu的根、叶、花，收载于《贵州省中药材、民族药材质量标准》，是贵州少数民族聚集地、苗医院及市(州)级中医院应用广泛的民族药之一，别名水冬瓜、水五加、接骨丹等，具有活血祛瘀、舒筋接骨的功效，主要用于哮喘、瘀血劳伤、骨折、跌扑损伤等[1]。《中华本草》等记载该药味苦、辛、微麻，性平，用于风湿关节痛、产后腰痛、慢性肠炎、腹泻，外用治骨折、跌打损伤等[2-3]。由于该药临床疗效好，是治疗各类骨折、跌打损伤、肌肉劳伤等症的理想用药，该药被《黔南本草》[4]、《贵州民间方药集》[5]等诸多地方本草收载。目前，国内外对大接骨丹药材的研究主要集中在化学成分相关研究，如大接骨丹药材主含苯丙素苷、环烯醚萜苷、黄酮苷、二萜等化学成分，已确定的单体化合物如紫丁香苷[6]、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、黄芪苷、β-谷甾醇、硬脂酸、软脂酸、10-Griselinosidic acid等[6-11]，同时，现代生物活性实验研究表明大接骨丹树皮具有较好的抗炎、镇痛[12]、免疫抑制[10-11]等作用，而关于大接骨丹根皮含量测定相关研究尚未见报道。研究表明，紫丁香苷具有抗炎[13-14]、保肝作用[15-16]等生物活性，这可能与该药在临床与民间的广泛应用有密切关系，紫丁香苷为该药的活性成分之一。课题组根据预实验的结果并结合后期实验研究的基础上，首次采用反相高效液相色谱梯度洗脱法建立了黔产大接骨丹根皮药材中紫丁香苷的含量测定方法，并对收集到的16批黔产大接骨丹根皮药材进行了含量测定，为大接骨丹根皮药材的质量控制及合理开发利用资源提供参考与依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器 Agilent 1260型高效液相色谱仪(二极管阵列检测器，在线真空脱气机、四元梯度泵、自动进样器、柱温箱及Chemstaion化学工作站，美国安捷伦科技公司)；BP211型电子分析天平(德国赛多利斯)。

1.2 材料 紫丁香苷对照品(批号：160120，成都克洛玛生物科技有限公司)，乙腈(色谱纯，批号：20160710，天津科密欧化学试剂有限公司)，磷酸(分析纯，批号：20140201，重庆川东化工(集团)有限公司)，水为娃哈哈矿泉水(批号：20160504，杭州娃哈哈集团有限公司)，乙醇(分析纯，批号：20160401，重庆川东化工(集团)有限公司)，其他试剂均为分析纯。

16批大接骨丹根皮药材均为自采，所有药材均经黔南民族医学高等专科学校药学系中药教研室王传明副教授鉴定为山茱萸科植物有齿鞘柄木ToricelliaAngulataOliv.var.intermedia(Harms) Hu的根皮。见表1。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 对照品溶液 精密称取紫丁香苷对照品适量，置于25mL量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得到紫丁香苷照品储备液浓度为0.5761mg/mL。

表1 大接骨丹根皮药材来源

2.1.2 供试品溶液 称取大接骨丹根皮药材粉末(过四号筛)约0.5g，精密称定，置50mL圆底烧瓶中，精密加入甲醇10mL，称定重量，回流提取1h，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液用0.45 μm 微孔滤膜滤过，即得。

2.2 色谱条件 采用Agela Promosil C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)，检测波长为220nm，进样量为10 μL，柱温为35 ℃，流速为1.0 mL/min，流动相为乙腈(A)-0.5%磷酸水(B)梯度洗脱(0～20min，10%～25% A；20～50min，25%～65% A；50～50.1min，65%～10% A；50.1～65min，10% A)，记录65 min的色谱图。对照品和大接骨丹根皮药材样品的色谱图见图1。

2.3 方法学考察

2.3.1 线性关系考察 分别精密吸取紫丁香苷对照储备液0.5、1、2、3、4、5 mL于10mL量瓶中，分别用甲醇稀释到刻度，摇匀，即得。分别注入高效液相色谱仪并测定各成分的色谱峰面积，得到进样量C(μg)与峰面积A的线性方程。结果表明，紫丁香苷进样量在0.2881～2.8805μg范围内与峰面积呈良好的线性关系，线性方程分别为A=69.689C+ 2.1178 (r=0.9995)。

2.3.2 精密度试验 取对照品溶液，连续进样6次，测定紫丁香苷峰面积。结果表明，计算紫丁香苷的RSD值为1.08%，表明仪器精密度良好。

2.3.3 重复性试验 取大接骨丹根皮药材样品6份，按照“2.1.2”项下的方法进行操作，制备供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件分别进样分析，测得紫丁香苷峰面积的RSD值为2.24%，表明该分析方法重复性良好。

2.3.4 稳定性试验 取大接骨丹根皮(S3)供试品溶液，分别于0、2、4、6、12、24、36h进行分析，考察紫丁香苷峰面积，结果表明，紫丁香苷峰面积的RSD值为2.36%，表明供试品溶液在36 h内基本稳定。

2.3.5 加样回收率试验 精密称取已知含量的大接骨丹根皮(S3)药材粉末约0.25g，共6份，每组分别精密加入0.5701g/L紫丁香苷对照品溶液1mL，混合均匀，按照“2.1.2”项下的方法进行操作，制备供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件分别进样分析。结果表明，紫丁香苷平均加样回收率(n=6)为100.53%，RSD为1.68%，结果见表2。

表2 加样回收率试验结果 (n=6)

2. 4 样品含量测定 分别按照“2.1.2”项下的方法进行操作，制备供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件分别进样分析，对16批自采大接骨丹根皮(即水冬瓜根皮)药材进行含量测定，计算紫丁香苷的含量，结果见表3。

表3 16批大接骨丹根皮药材中紫丁香苷的含量

3 讨论

3.1 样品提取条件的优化 试验考察比较了甲醇、70%乙醇、90%乙醇等不同溶剂和超声、回流、冷浸等方法，其中，以甲醇回流提取1h 提取效果较好。

3.2 色谱条件的优化 预试验应用二极管阵列检测器对大接骨丹根皮药材波长进行检测，参照3D立体图构向分析，发现在220nm 处，紫丁香苷色谱吸收相对较大且分离度高，在线梯度洗脱时，基线平稳，故确定检测波长为220nm。考察了甲醇-水、甲醇-磷酸水、乙腈-水、乙腈-磷酸水等流动相系统，结果表明本实验采用乙腈-磷酸水具有较高的分离度。考察了不同色谱柱、不同柱温及不同流速下的分离效果，最终确定了本实验的色谱分析条件。

3.3 含量测定指标性成分的选择 含量测定指标性成分的选择时，通常选择峰面积较大且保留时间居中的色谱峰作为指标性成分，但是，由于2-8号峰为未知化学成分，根据文献[2-6]，课题组利用液质联用技术及对照品比较法尝试对大接骨丹根皮药材中的多种化学成分进行指征，但由于该药物质基础研究相对薄弱，课题组通过液质联用技术及对照品比较法，仅指征了图谱中1号峰为“紫丁香苷”，并最终确定1号峰紫丁香苷作为本研究含量测定的指标性成分。

含量测定结果表明，自采的16批黔产大接骨丹根皮药材中紫丁香苷的含量差异较大，说明各批次药材质量存在明显差异，各产地药材成分含量差异较大的原因可能是由于大接骨丹药材的生长环境、不同采收期、不同生长期等影响因素造成。同时，应加强针对大接骨丹根皮(即水冬瓜根皮)物质基础的深入研究，同时，基于物质基础，开展指纹图谱的深入研究[17]，对大接骨丹根皮(即水冬瓜根皮)不同部位、不同采收期确定研究以及质量标准的提升。

[1]林亚平，叶阳明.贵州省中药材、民族药材质量标准[M]. 贵阳：贵州科技出版社，2003：107.

[2] 南京中医药大学.中药大辞典[M]. 2版.上海：上海科学技术出版社，1995：197.

[3] 贵阳中医学院.中华本草(苗药卷)[M].贵阳：贵州科技出版社，2005：164.

[4] 司有奇.黔南本草(上册)[M]. 贵阳：贵州科技出版社，2015：107.

[5] 杨济秋，杨济中.贵州民间方药集[M]. 3版.贵阳：贵州人民出版社，1978：126.

[6] 吴少华，马云保，罗晓东，等.大接骨丹化学成分 [J].云南植物研究，2000，22(2)：214-218.

[7] 张锦文，郭洁茹，唐菲，等.大接骨丹化学成分研究 [J].中药材，2010，33(11)：1725-1727.

[8] 王燕燕，涂念，张勇慧，等.大接骨丹化学成分研究(Ⅱ)[J].中草药，2009，40(10)：1551-1553.

[9] 张锦文，郭洁茹，唐菲，等.大接骨丹化学成分研究(Ⅲ)[J].中草药，2011，42(1)：15-17.

[10] 王晶.大接骨丹免疫活性成分研究 [D].武汉：华中科技大学，2008：9-30.

[11] 涂念.大接骨丹免疫调节活性成分研究[D].武汉：华中科技大学，2009：7-35.

[12] 陈华栋，张锦文，张勇慧.大接骨丹干燥树皮抗炎镇痛活性有效部位筛选[J].海峡药学，2012，24(2)：29-30.

[13] 张羡援，李贺然.刺五加根的抗炎活性成分研究[J].中国医药导报，2016，13(13)：20-23.

[14] 马玉玲，薛志远，高霞，等.基于化学计量学的川木香抗炎活性谱效关系研究[J].分析测试技术与仪器，2016，22(1)：15-22.

[15] 杨文娟，齐香君，郑艳，等.紫丁香苷对小鼠急性肝损伤的保护作用[J].天然产物研究与开发，2007，(19)：473-474.

[16] 姜月红，王燕颖.紫丁香苷对大鼠肝缺血再灌注损伤保护作用的初步研究[J].中国实验诊断学，2016，20(3)：359-361.

[17]韩忠耀，余跃生.魏学军，等.苗药水冬瓜根皮药材高校液相色谱指纹图谱研究[J].中国医院药学杂志，2017,37(2)：126-129.

Determination of Syringin Contents in Root Bark ofToricelliaAngulataOliv.var.Intermedia(Harms) Hu in Guizhou by RP-HPLC

HAN Zhongyao1LI Yan1LI Fangfang1LU Tingxiang1YANG Shuxiang1WEI Xuejun1*

1.Qiannan Medical College for Nationalities,Duyun 558000,China; 2.ShangCai County People’s Hospital， ShangCai 463800,China

Objective To establish an HPLC method for the content determination of syringin in the root bark ofToricelliaAngulataOliv.var.intermedia(Harms) Hu for its quality control.Method Agela Promosil C18(4.6mm×250mm，5μm)column was used and eluted with the mobile phase of acetonitrile-0.5% phosphoric acid solution in a gradient mode,the flow rate was 1.0mL/min,column temperature was 35 ℃.The detection wavelength was at 220 nm,the analytical time was 65 min. Syringin of 16 batches in the root bark ofToricelliaAngulataOliv.var.intermedia(Harms) Huwere detected.Result The linear ranges for syringin was 0.2881～2.8805μg(r=0.9995).Their average recoveries(n=6) were 100.53% and theRSDwas 1.68%,respectively.Conclusion The method is simple,rapid,accurate and can be used for quality control of the root bark ofToricelliaAngulataOliv.var.intermedia(Harms) Hu.

ToricelliaAngulataOliv.var.intermedia(Harms) Hu;HPLC; Syringin；Quality Control

黔南州科学技术和知识产权局社会发展(卫生类)科技计划项目(黔南科合社字(2016)28号)；黔南民族医学高等专科学校科研基金(QNYZ201503)。

韩忠耀(1981-)，男，汉族，硕士，讲师，主管药师，研究方向为中药、民族药质量控制。E-mail:317230913@qq.com

魏学平(1972-)，男，汉族，教授，研究方向为中药、民族药质量控制。E-mail:870170786@qq.com

R914

A

1007-8517(2017)04-0030-03

2016-12-16 编辑：梁志庆)