大孔树脂富集新疆啤酒花中总黄酮工艺研究

朱 佳 胡月月 葛 亮*

1.新疆自治区第一济困医院，新疆 乌鲁木齐 830017； 2.新疆医科大学中医学院，新疆 乌鲁木齐 830011

大孔树脂富集新疆啤酒花中总黄酮工艺研究

朱 佳1胡月月2葛 亮2*

1.新疆自治区第一济困医院，新疆 乌鲁木齐 830017； 2.新疆医科大学中医学院，新疆 乌鲁木齐 830011

目的：筛选适合富集新疆啤酒花中总黄酮的大孔吸附树脂并确定纯化工艺参数。方法：以静态吸附下大孔树脂的吸附率和解析率为指标，确定富集总黄酮的最佳大孔树脂，并明确新疆啤酒花中总黄酮的最佳富集工艺。结果：D-101型树脂对新疆啤酒花中总黄酮有良好的富集效果，其具体的工艺参数条件为：上样浓度为0.5g/mL，最大上样量为1.5BV，上样流速为1.0mL/min，洗脱剂为50%乙醇，洗脱剂用量为5BV，洗脱流速为1.0mL/min。结论：采用D-101型大孔吸附树脂可有效富集新疆啤酒花中总黄酮类成分。

新疆啤酒花；总黄酮；大孔吸附树脂

啤酒花(HumulusLupulusL.)是桑科葎草属多年生草质蔓生藤本植物，其雌性球穗花序简称酒花[1]。它是一种较耐寒不耐热的植物，主要分布于我国西北地区、新疆北部、东北、华东及山东、甘肃、陕西等地。我国啤酒花产量约占全世界的13%，仅次于美国和德国，居世界第三位[2]。啤酒花中含有黄酮类、树脂类、挥发油、鞣质、胆碱、粗纤维、氨基酸等多种化学成分[3]。.其味苦、性平，有健胃、消食、利尿、安神、止咳化痰之功效，其具有抗氧化[4]、抗病毒[5]、抗肿瘤和植物雌激素样作用[6]、镇静[7]、治疗结核[8]、神经衰弱[9]等多种功效。新疆啤酒花在新疆自治区有广泛分布，并且储量丰富，经过查阅已有对新疆啤酒花进行相关的研究，如总黄酮、总多糖的提取与含量测定、微量元素与挥发油的分析，但是对其主要活性成分总黄酮类化合物的富集工艺研究未见相关报道，本实验是对采用大孔吸附树脂对新疆啤酒花中主要的总黄酮类成分进行富集，为其进一步研究提供相关数据。

1 仪器与材料

1.1 仪器 TU-1810可见紫外分光光度计(北京普析通用公司)；BN-1型旋转蒸发仪(郑州长城科工贸易有限公司)；KQ3200DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；BS220S电子天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)。

1.2 材料 新疆啤酒花采自新疆自治区乌鲁木齐市昌吉地区，经新疆医科大学中医学院中药资源教研室徐海燕副教授鉴定为菊科植物新疆啤酒花HumulusLupulusL.的干燥地上部分和根。芦丁标准品(批号：100080-201605，中国食品药品检定研究院)，AB-8、X-5、D-101、HPD-300、HPD-100、HPD-400购置于河北沧州宝恩吸附材料科技有限公司。所用试剂均为分析纯。

2 方法及结果

2.1 测定方法的建立

2.1.1 标准品溶液制备 精密称取于干燥至恒重的芦丁10.00mg，置于50 mL的量瓶中，加入60%乙醇超声溶解，加入60%乙醇定容至刻度，摇匀，制成0.2mg/mL的芦丁标准品溶液。

2.1.2 标准曲线建立 分别精确吸取标准品溶液0、1、2、3、4、5、6mL至25mL容量瓶中，各加入60%乙醇至6 mL，先加入5%NaNO2溶液1mL，混匀，放置 6min；再加入10% Al(NO3)3溶液1 mL，混匀，放置6min；接着加入4%NaOH溶液10mL，摇匀，最后加入60%的乙醇定容至刻度，放置15min，以510nm处的吸光度(Y)为纵坐标，以样品浓度(X)为横坐标，得标准曲线方程：Y=9.8624X-0.0054，r=0.9997，线性范围为0.008～0.048 mg/mL。

2.1.3 提取液制备[10]称取新疆啤酒花药材粗粉200g， 60%乙醇超声提取40min，料液比为1∶15，过滤，经测定总黄酮含量为8.1mg/g。

2.2 树脂预处理[11]将新购买的大孔树脂用95%乙醇浸泡24h，湿法装柱后，用95%乙醇洗脱，到水与流出液混合不呈白色为止，再用适量水洗尽乙醇至无醇味，备用。

2.3 大孔树脂类型的筛选 称取处理好的6种大孔吸附树脂：AB-8、X-5、D-101、HPD-300、HPD-100、HPD-400、各2g，放入25mL锥形瓶中，然后再加入20mL的新疆啤酒花溶液，在恒温振荡器连续振摇24h。过滤后得到吸附液，放入25mL容量瓶中，以60%乙醇定容。测定各吸附液中的总黄酮浓度，按照公式计算各树脂的吸附率和吸附量。并将上述吸附饱和后的树脂，再加入95%乙醇20mL置于锥形瓶中，振荡24h进行洗脱，测定洗脱液中的总黄酮浓度，并计算各树脂的解析率。

吸附率=(Po-Pa)/Po(%)

式中Po:样品液中总黄酮的初始浓度(mg/mL)；Pa：吸附平衡后溶液中总黄酮浓度(mg/mL)

吸附量=(Po-Pa)×V/W

式中Po:样品液中总黄酮的初始浓度(mg/mL)；Pa：吸附平衡后溶液中总黄酮浓度(mg/mL)；V：样品液的体积(mL)；W：树脂重量(g)

解析率=(洗脱液浓度×洗脱液体积)/(样品液的初始浓度-平衡液中样品浓度)×样品体积×100%，结果见下表1。

表1 树脂吸附考察结果

根据表1，考虑不同树脂在静态吸附-解析实验中的结果，确定D-101树脂为富集新疆啤酒花中总黄酮的最佳树脂。

2.4 大孔树脂富集总黄酮有效部位工艺考察

2.4.1 最佳上样浓度筛选 分别量取浓度0.4、0.5、0.6 g/mL的样品溶液各30mL，以1.0mL/min的流速上样，吸附后再测定各流出液中总黄酮的含量，并计算其洗脱率。结果表明，上样液浓度为0.5g/mL，洗脱率最高，结果见表2。

表2 最佳上样浓度筛选结果

2.4.2 最大上样体积选择 量取0.5 g/mL的上样液100mL，以1.0 mL/min的速度进行上样，以每5mL为1份，收集各份洗脱液，并测定其总黄酮含量，确定最大上样量样品中总黄酮浓度从第6份处浓度率显著增大，在此处开始泄漏。综合考虑，确定30mL为最大上样量，即1.5BV。，实验结果见图1。

2.4.3 最佳上样流速筛选 量取0.5 g/mL的上样液适量，分别以0.5、1.0、1.5mL/min流速上样，收集各流速下的流出液，测定其总黄酮含量，计算洗脱率，结果选择吸附流速为1.0 mL/min，结果见表3。

表3 最佳上样流速选择结果

2.4.4 最佳洗脱溶剂与用量的选择 量取0.5g/mL的样品溶液30mL，加于20mL(1BV)D-101树脂柱上，以1.0 mL/min的速度进行吸附，先用水(3BV)洗除杂，再采用20%，30%、50%、70%、95%乙醇各120mL(6BV)进行洗脱，每1BV收集一次，以1mL/min流速洗脱，测定各洗脱液中总黄酮的浓度，确定最佳洗脱溶剂为50%乙醇。

由图2可知，总黄酮浓度从第5份以后，总黄酮浓度变化不大，综合考虑确定洗脱剂用量为5BV。

2.4.5 洗脱流速的筛选 量取0.5g/mL的上样液1.5BV(30mL)，以1.0mL/min的速度上样，用水(3BV)洗去杂质，再用50%的乙醇分别以0.5、1.0、1.5mL/min的流速洗脱，收集洗脱液，测定洗脱液中的总黄酮的含量，综合考虑以1.0mL/min为洗脱流速，结果表4。

表4 最佳洗脱流速的选择

2.4.6 树脂重复使用次数考察 按上述确定的最佳富集条件，取含0.5g/ mL 药液过柱，在同一根树脂柱上重复操作4次，测定4次洗脱液中总木脂素的含量并计算洗脱率，结果见表5。 可见树脂重复使用 4次后，对总木脂素的吸附与解吸性能未见明显变化，故树脂可以重复使用 4次以上。

表5 树脂重复使用次数考察

3 讨论

新疆啤酒花在新疆分布广泛，具有明显的地域特色，目前对其研究并不深入，查阅相关文献，发现对其黄酮类成分研究较多。大孔吸附树脂是一种新的富集有效成分的常规方法，常用于中药活性成分的纯化工艺研究，可以得到纯度较高的中药有效部位，为相应的后期相关研究提供数据和参照。

实验对新疆特色啤酒花中总黄酮类成分进行深入研究，采用NaNO2- Al(NO3)3-NaOH法对其总黄酮含量进行检测，该方法稳定可靠。并采用静态吸附和动态筛选确定了最佳的树脂类型-D-101大孔吸附树脂，该树脂使用十分广泛，广泛的用于中药材中总黄酮类成分的富集纯化工作，具有良好的实验效果。综合考虑确定新疆啤酒花中总黄酮的最佳富集工艺为：采用D-101大孔树脂，取30mL (1.5BV)0.5g/mL的上样液，以1mL/min的速度上样，水洗除杂，再用5BV 50%乙醇以1.0mL/min-1的速度洗脱。按最佳富集工艺进行所得的洗脱物中总黄酮含量为73.52%，总黄酮富集效果十分显著，可为新疆啤酒花的进一步深入研究打下基础。

[1]Benitez J L，Forster A，Keukeleire D，et al．Hops and hop products，manual of good practice[J]．EBC Verlag Hans Carl, 1997, 14(5):79-83.

[2]赵素华,刘奎访,刘是,等.新疆啤酒花新品种阜北-1的成分分析比较[J].西北植物学报,2000,20(6):1110- 1113.

[3]周娟,邹翔,季宇彬.啤酒花的有效成分及活性研究[J].哈尔滨商业大学学报(自然科学版),2005,21(4):414-417.

[4]NEWALL C A．Herbal Medicines：A guide for health care professionals[M]．London：The Pharmaceutical Press，1996:162-163．

[5]SHIPP E B，MEHIGH C S.HELFERICH W G．The effect of colupulone(a hops beta-acid) on hepatic cytochrome P-450 enzymatic activity in the rat[J].Food and Chemical Toxicology，1994,32:1007-1014．

[6]YASUKAWA K， TAKEUCHI M，TAKIDO M．Humulone，a bitter in the hop，inhibits tumor promotion by 12-0-tetradecanoylphorbol-13- acetate in two-stage carcinogenesis in mouse skin[J].Oncology,1995,52(2):156-158.

[7] 汪开治.安神健胃啤酒花[J].植物杂志,2002,15(4):13．

[8] 蔡克霞，刘敬鹏.啤酒花在抗结核治疗中的应用[J].青海医学院学报,1995,16(4):41-42．

[9] Fussel A，Wolf A，Brattstrom A．Effect of a fixed valerian hop extract combination(Ze 91019)on sleep polygraphy in patients with non-organic insomnia：a pilot study[J].Eur JMed Res,2000,32(5):385-390．

[10] 何文静,杨建,刘洁.超声波法提取啤酒花中总黄酮的工艺研究[J].安徽农业科学,2011,39(7):4039-4040.

[11] 韩伟,孙晓海,顾晓栋,等.鸡血藤中总黄酮的大孔树脂纯化工艺[J].南京工业大学学报(自然科学版),2010,32(6):26-30.

Enrichment of Total Flavonoids inHumulusLupulusL in Xinjiang by Macroporous Resin

ZHU Jia1HU Yueyue2GE Liang2*

1.The first aid hospital of Xinjiang autonomous region, Urumqi 830017, China; 2. College of Traditional Chinese Medicine, Xinjiang Medical University, Urumqi 830011, China

Objective Screen the macroporous resins for enrichment the total flavonoids inHumulusLupulusL. from Xinjiang and make sure the optimum parameters of purification. Methods The adsorption rate and resolution rate with macroporous adsorption resin static adsorption rate were as the index, screening out the enrichment of total flavonoids best resin inHumulusLupulusL. and the optimum conditions for purification the total flavonoids inHumulusLupulusL. was finished.Results D-101macroporous resin could enrich the total flavonoids ofHumulusLupulusL.The specific process parameters were: sample concentration was 0.5g·mL-1,maximum sample volume is 1.5 BV, control the sample flow rate of 1.0 mL/min, the eluent concentration is 50% ethyl alcohol, elution volume was 5 BV,the eluent flow rate of 1.0 mL/min.Conclusion D-101 macroporous adsorption resin could purify the total flavonoids inHumulusLupulusL. from Xinjiang.

XinjiangHumulusLupulusL； Total Flavonoids; Macroporous Resin

新疆自治区科技基础条件平台建设项目(NO：PT1513)。

朱佳(1980-)，女，学士，主管中药师，研究方向为医院药学研究。

葛亮(1980-)，男，博士，高级实验师，研究方向为中药民族药研究。

R914

A

1007-8517(2017)04-0020-03

2016-12-09 编辑：梁志庆)