柯萨奇病毒B组4型河南分离株VP1区基因特征分析

许玉玲 王海霞 卫海燕 黄学勇

450016 郑州，河南省疾病预防控制中心传染病预防控制所 河南省传染病病原生物重点实验室

人类肠道病毒B组的柯萨奇B4病毒(CoxB4)感染机体后，可以导致无临床症状的隐性感染，也可引起多种临床疾病，如手足口病、脑膜炎、咽峡炎、发热出疹性疾病、儿童多动症(ADHD)、胰腺炎和儿童I型糖尿病等。2013年从河南手足口病监测网络分离出8株该病毒，对其进行VP1区扩增，分析序列特征，并与其他疾病CoxB4分离株进行VP1区基因特征分析，查找可能与致病机制相关的基因特征，为手足口病的深入研究提供理论基础。

1 材料与方法

1.1样本来源粪便标本来自2013年河南省各地市疾病预防控制中心和医院的手足口患儿，-70 ℃ 保存备用。

1.2实时荧光检测按照手足口病实验室检测方案，对粪便进行前处理，离心后取上清200 μl，用Qiagen公司的QIAamp Viral RNA Mini Kit试剂盒提取病毒RNA。江苏硕士有限公司的单通道EV71、CA16和肠道通用实时荧光RT-PCR检测试剂盒检测标本。反应体系为25 μl： RT-PCR反应液7.5 μl，相应反应液4 μl，酶混合液5 μl，纯水3.5 μl，模板RNA 5 μl，充分混匀，6 000×g离心60 s，使用BIORAD- iQ5仪器进行实时RT-PCR检测。扩增程序：50 ℃ 30 min；95 ℃ 5 min； 95 ℃ 10 s，55 ℃ 40 s(收集荧光)，45个循环，实验设置阴性和阳性对照，结合Ct值和扩增曲线判读结果。

1.3病毒分离和鉴定将肠道通用检测阳性的标本，每份选择200 μl接种人横纹肌肉瘤细胞(human rhabdomyosarcoma, RD) 和人喉癌上皮细胞(human laryngeal carcinoma, HEp-2)，置于5%CO2、36 ℃培养箱，连续培养3～7 d，每天观察记录细胞变化，每个标本传2代，若均没有出现致细胞病变效应(cytopathic effect, CPE)，则判为阴性，只要一种细胞出现了肠道病毒特异CPE，则在CPE达到 +++时收获细胞，并提取病毒RNA。先用通用引物008,013(见表1)行PCR扩增、测序、网上比对获得基因型，选择基因型为CoxB4的毒株进行下一步实验。

1.4VP1基因引物设计利用生物学软件Primer 5.0设计VP1区引物，序列参考CoxB4病毒中国分离株(KF781524)和原型株(X05690)的VP1序列，见表1。引物由上海生工生物科技有限公司合成。

表1 肠道病毒通用和CoxB4 VP1扩增引物

1.5CoxB4毒株VP1区扩增取出已鉴定为CoxB4的RNA，试剂用QIAgen onestep RT-PCR kit(Cat. No. 210212)，反应体系50 μl：5×buffer 10 μl，Enzymix 2 μl，Rnasin 0.2 μl，上下游引物(25 μmol/L)各0.8 μl，dNTP 2 μl， RNA4 μl，H2O 29.2 μl。反应条件为：50 ℃ 30 min；95 ℃ 15 min；94 ℃ 40 s，50 ℃ 50 s，72 ℃ 60 s，35个循环；72 ℃ 10 min。实验设立阴性对照。取PCR产物5 μl在1.5%琼脂糖凝胶中电泳分析，阳性产物送南京金斯瑞生物科技有限公司进行测序。

1.6生物信息学分析使用生物学软件ATGC进行序列拼接，Clustalx1.83进行序列比对，BioEdit进行VP1剪齐，Mega4.0软件进行同源性分析和构建系统进化树，对CoxB4原型株JVB、8株CoxB4河南分离株与其他28个代表株进行了系统进化分析。并选择11株不同疾病来源的病毒分离株进行VP1区氨基酸不同位点分析，参比序列来自GenBank已公布序列(只列出有疾病来源的毒株，部分基因分型毒株未列出)，见表2。

表3 不同疾病COXB4分离株VP1氨基酸不同位点分析

注：1～3为手足口病分离株，4～6为无菌性脑膜炎分离株，7～10为糖尿病分离株，11为胸腹痛分离株(原型株JVB)

Notes： 1-3 are isolates from HFMD, 4-6 are isolates from aseptic meningitis, 7-10 are isolates from diabetes patients, 11 is isolate from patient with chest and abdominal pain (prototype strain of JVB)

2 结果

2.1荧光RT-PCR检测结果2013年检测手足口病粪便标本540份，其中EV71阳性标本290份，CA16阳性98份，肠道通用阳性134份，通用阳性标本构成比24.8%。

2.2病毒分离与鉴定134份标本经两种细胞培养进行病毒分离，出现明显CPE现象的有35份标本。将这些病毒提取RNA后用肠道通用引物PCR扩增送测序比对，确定8份为CoxB4毒株。CoxB4阳性率5.9%。

2.3VP1区基因分析所有CoxB4河南分离株VP1区核苷酸长度均为852个核苷酸，编码284个氨基酸； VP1区核苷酸同源性分析，8株河南分离株与原型株JVB为83.2%～85.8%，与糖尿病分离株为80.3%～86.0%，与其他手足口病株为90.8%～97.0%。与糖尿病患者分离株E2核苷酸差异最大达19.7%，与手足口病分离株差异最小为3.0%。

2.4遗传进化分析37株代表株进化树见图1，CoxB4共有Genotype I～V五种基因亚型，8株河南分离株与中国近年手足口病分离株、无菌性脑膜炎分离株分布一簇，属于Genotype V亚型。11株不同疾病来源CoxB4代表株共有14个位点氨基酸发生改变，3株无菌性脑膜炎分离株在14个位点中有12个位点氨基酸编码一致，4株糖尿病分离株有6个位点一致，原型株JVB与糖尿病分离株Tuscany编码位点完全一致，进化树也在一个分支，3株手足口病患者分离株有8个位点完全一致。手足口病分离株与糖尿病病毒株仅在氨基酸编码位点575完全不同，手足口病株在该位点均编码丙氨酸，而糖尿病株编码丝氨酸，其他位点没有明显规律和特点，见表3。

注：▲代表CoxB4河南分离株图1 CoxB4基于VP1区的遗传进化分析Note:▲ indicates Henan CoxB4 isolatesFig.1 Phylogenetic analysis based on the Cox.B4 VP1 nucleotide sequence

3 讨论

肠道病毒型别有100多种，很多都可引起手足口病。 EV71和CA16一直是手足口病的主要病原体，2013年末非EV71非CA16的其他肠道病毒呈上升趋势，CA6一度成为西安、云南、杭州等地的优势毒株[1-2]，CA10、CoxB5、CoxB4、Eco11等也经常出现在手足口病监测网络数据中。

CoxB4病毒属于较易分离到的一种人类肠道病毒，和其他人肠道病毒一样，传播途径为粪口和接触传播，儿童卫生习惯稍差，抵抗力较低，是此类病毒的易感人群。CoxB4病毒常引起婴幼儿脑炎、脑膜炎、心肌炎、手足口病和糖尿病[3-5]，严重者会导致全身多系统衰竭而死亡。该病毒的原型株JVB于1951年分离于美国一个胸腹痛患者的粪便标本，1958年在糖尿病患者粪便标本中获得E2株，此后研究发现E2的变异株E2b及从糖尿病患者的胰腺组织里获得的Tuscany分离株，近年从脑炎患者及手足口病患者中分离出多株CoxB4病毒株。全球均有该病毒暴发或散在病例的报导，中国台湾在跨入2000年后，曾有多次散发和暴发报道，2004和2008年都有CoxB4感染的暴发，患者多有心肌炎症状[6]；2010年广西报道一例手足口病患者感染该病毒致死亡病例[7]；同年内蒙古从手足口病监测系统中分离出多株CoxB4病毒[8]；美国、法国、丹麦、芬兰等多个国家研究者都有该病毒发现的研究报道。

CoxB4病毒进化树基因分型的研究报道不一致，有研究者将之划分为基因亚型I～VIII[6]，有研究者将之分为基因型I～V 5种基因亚型[8]。可能两者选择的基因片段并不一致，本文采用VP1全长基因进行系统进化分析，与2014年内蒙古的研究结果一致，所有CoxB4病毒共分为基因型I～V 5种基因亚型，这8株河南分离株与2010年广西手足口病分离株遗传距离最近，与云南、山东省无菌性脑膜炎患者分离株同源性较高，处于同一簇分支，属于基因型V基因亚型；与糖尿病病毒分离株E2b和E2遗传距离较远，糖尿病分离株大都位于基因型II亚型；而原型株JVB分离于胸腹痛患者，它与2007年美国一糖尿病患者分离株在同一分支，同属于基因型I亚型。

CoxB4病毒可引起的疾病谱广泛，有糖尿病、儿童多动症、手足口病、心肌炎、脑膜炎、胸腹痛等。周密报道引起糖尿病的病毒株在基因非结构蛋白3 A区氨基酸变异与原型株有多个位点不同，提示3 A蛋白的变异可能会改变病毒复制增殖的能力[9]。VP1是决定肠道病毒血清分型的主要部位，属于高度变异区，本研究选择几种不同疾病分离获得的病毒株进行VP1核苷酸和氨基酸异同分析，尝试发现糖尿病株、手足口病分离株、胸腹痛分离株(原型株JVB)、脑膜炎分离株等在主要抗原决定簇中的基因差别。分析发现，CoxB4河南分离株VP1区均为852 bp，与GenBank公布的其他分离株VP1核苷酸相似性为80.3%～97.0%，氨基酸相似性96.1%～100%；与糖尿病患者分离株E2核苷酸差异最大达19.7%，与手足口病分离株差异最小为3.0%。VP1基因序列的改变导致氨基酸编码改变，手足口病分离株、糖尿病分离株和原型株在VP1氨基酸编码中共有14个位点不一致，而同种疾病来源的病毒株VP1氨基酸编码不相同位点较少，糖尿病分离株间、手足口病分离株间氨基酸同源性可达98%以上，糖尿病和手足口病分离株仅在位点575是完全不同的，手足口病株在该位点均编码丙氨酸，而糖尿病株均为丝氨酸，是否此位点氨基酸的改变引起不同疾病的发生还需要大量病毒株基因序列的比对及后续更深入的研究。患者临床疾病的出现由病毒的致病力、发病机制决定，但也与个人体质有一定关系，需要对病毒进行更为深入的研究，才能有更好的解释。

该研究通过河南省手足口病CoxB4分离株VP1基因分析，对不同疾病来源的病毒株绘制系统进化树，分析这些病毒该序列氨基酸差异，有助于完善我国CoxB4病毒株的基因信息，加强病毒变异检测，为后续深入研究奠定基础。

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