忍冬藤可溶性膳食纤维提取及性能分析

郭凤倩，黄祖顺，朱宝磊，刘谦

(山东中医药大学药学院，山东 济南 250355)

【中药与天然活性产物】

忍冬藤可溶性膳食纤维提取及性能分析

郭凤倩，黄祖顺，朱宝磊，刘谦*

(山东中医药大学药学院，山东 济南 250355)

探讨纤维素酶法提取忍冬藤中水溶性纤维素的最佳工艺并对其性能进行分析。在单因素试验基础上，采用正交试验对提取工艺进行优化得到最佳工艺条件组合为pH=4.8，温度45 ℃，料液比1:12(g/mL)，纤维素酶体积分数1.2%，提取时间6 h，浸提3次。在此条件下，水溶性膳食纤维的提取率为3.57%，所提取的水溶性纤维素持水力为6.1 g/g，膨胀力为5.3 mL/g，持油力为4.53 g/g，阳离子交换能力为0.58 mmol/g，DPPH自由基最大清除率为80.13%，具有较好的理化性能。研究认为，纤维素酶解法可用于提取忍冬藤中的水溶性膳食纤维。

忍冬藤；水溶性膳食纤维；纤维素酶；性能

膳食纤维是一种复杂的混合物的总称，具有多种生理功能，可预防痔疮、直肠癌、结肠癌、糖尿病、乳腺癌和肥胖症等症，被列为继糖、蛋白质、脂肪、水、矿物质和维生素之后的“第七营养素”[1]。膳食纤维主要存在于大部分谷物、水果和蔬菜中，分为水溶性膳食纤维(soluble dietary fiber， SDF)和水不溶性膳食纤维(insoluble dietary fiber ，IDF)。SDF存在于果胶和凝胶中，为半纤维素多糖，易被肠道微生物所用。IDF存在于植物细胞壁中，为纤维素、木质素和半纤维素，有利于促进肠道蠕动，帮助消化。

忍冬藤为忍冬科植物忍冬(LonicerajaponicaThunb.)干燥的藤茎。《本草纲目》载“忍冬，茎叶及花，功用皆同”，具有清热解毒、疏散风热的功效。目前山东省金银花药材年产量达2万吨，忍冬藤产量至少10万吨。目前忍冬藤主要用于饲料加工、直接喂养牲畜或次生代谢成分提取，用于提取次生代谢物质的忍冬藤纤维素部分作为废弃物。利用忍冬藤SDF作为膳食纤维可以提高忍冬藤的利用率，提升忍冬药材的附加值。本试验参照国内多采用的化学-酶法相结合的提取膳食纤维方法[2]，以忍冬藤为原料，采用纤维素酶水解法从忍冬藤中提取SDF，并优化了提取工艺。

1 材料与方法

1.1 试验材料

忍冬藤：采自山东中医药大学药用植物园，经张永清教授鉴定为忍冬(LonicerajaponicaThunb.)的藤茎，105～120 ℃杀青，60 ℃下干燥 48 h，粉碎，过40目筛，备用。

试剂：α-淀粉酶(A109181-100g)、糖化酶(液化型 104U/mL)、纤维素酶C109262-5g(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；1,1-二苯基-2-苦基肼(DPPH分析纯，和光纯药工业株式会社)；乙醇、甲醇、盐酸、氢氧化钠、氯化钠、硝酸银、水杨酸、硫酸亚特、双氧水、磷酸二氢钾-磷酸氢二钾缓冲溶液和醋酸-醋酸钠缓冲溶液等均为分析纯；豆油。

1.2 仪器与设备

微型植物粉碎机(长沙市雨花区中诚制药机械厂)；PL203电子天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)；TDZ4-MS低速离心机(长沙高新技术产业开发区湘仪离心机仪器有限公司)；SHZ-D(III) 循环水式多用真空泵(巩义市英峪高科仪器厂)；恒温水浴锅(功率15 kW,常州博远实验分析仪器厂)；202-00S恒温干燥箱(长沙科仪仪器设备有限公司)。

1.3 忍冬藤SDF提取工艺

1.3.1 工艺流程

准确称取忍冬藤粉末(过40目筛)3.0 g，以蒸馏水为溶剂，加入α-淀粉酶，调节pH，60 ℃恒温水浴酶解，冷却至室温后调节pH，加入糖化酶，45 ℃恒温水浴酶解，冷却至室温后调节pH，加入纤维素酶，45 ℃恒温水浴酶解[3]，真空抽滤，4 000 r/min离心，浓缩，加入4倍量体积分数80%的乙醇醇析8 h，离心，倾去上清液，80～90 ℃干燥，得到SDF。

1.3.2 忍冬藤SDF提取率的计算

(1)

1.3.3 试验设计

以忍冬藤SDF提取率为指标，主要考察料液比、纤维素酶体积分数、酶解时间和浸提次数对SDF提取率的影响，根据公式(1)计算SDF，每个因素试验重复3次，所得结果取平均值。

1.3.3.1 最佳料液比的确定

准确称取5份样品，每份3.0 g，在pH=4.8，温度45 ℃，加入纤维素酶体积分数分别为1.0%的条件下，料液比(g/mL)分别设为1:9、1:12、1:15、1:17、1:25，均酶解6 h提取。

1.3.3.2 最佳酶解时间的确定

准确称取5份样品，每份3.0 g，在料液比(g/mL)为1:12，pH=4.8，温度45 ℃，加入纤维素酶体积分数为1.0%的条件下，分别酶解4、6、8、10、12 h，提取膳食纤维。

1.3.3.3 纤维素酶最佳添加量的确定

准确称取5份样品，每份3.0 g，在料液比(g/mL)为1:12，pH=4.8，温度45 ℃，纤维素酶添加量体积分数为0.5%、0.8%、1.0%、1.2%、1.5%的条件下，均酶解6 h。

1.3.2.4 最佳浸提次数的确定

准确称取5份样品，每份3.0 g，在料液比(g/mL)为1:12，pH=4.8，温度45 ℃，加入纤维素酶添加量体积分数为 0.2%的条件下，酶解6 h，分别提取1、2、3、4、5次。

1.3.4 正交试验设计

考察料液比、纤维素酶体积分数、浸提次数和提取时间，在单因素试验的基础上，采用正交试验对SDF提取工艺进一步优化，每个因素设置3个水平，根据SDF提取率优化试验工艺，见表1。

表1 正交试验设计

1.3.5 忍冬藤SDF性能测定

1.3.4.1 持水力测定

准确称取0.100 g样品，置于10 mL离心管中，加蒸馏水5 mL，室温下浸泡24 h后，5 000 r/min离心5 min，倾去上层溶液，甩干水分，称重[4]。

(2)

1.3.4.2 膨胀力测定

准确称取样品100 mg于带刻度的玻璃试管中，加蒸馏水5 mL。放置24 h ，不断搅拌。观察其自由膨胀体积，计算每克纤维素的膨胀体积[4]。

(3)

1.3.4.3 持油力

准确称取干物料0.2 g，放入50 mL离心管中，加入豆油10 mL，混合均匀，密封后于37 ℃下静置1 h，4 000 r/min离心15 min，弃上层油脂，称量剩余残渣的湿重[5]。

(4)

1.3.4.4 阳离子交换能力

37 ℃恒温条件下，用0.1 mol/L HCl溶液浸置样品24 h ，边抽滤边用蒸馏水洗去过量的酸，用质量分数 10%的AgNO3溶液鉴定至不含 Cl-为止，干燥样品。称取250 mg干燥样品，溶解于100 mL质量分数0.5% NaCl溶液中，用0.1 mol/L NaOH 溶液滴定，记录pH，作VNaOH- pH曲线图，以pH达到 7 时，每克样品所消耗 0.1 mol/L NaOH来衡量阳离子交换能力[6]。

(5)

1.3.4.5 DPPH自由基清除能力的测定

准确称取2.0 mg DPPH溶解定容于50 mL容量瓶中，于冰箱中避光保存。将SDF配成系列浓度梯度(1～200 mg/L)，精密量取2 mL样品溶液加入10 mL具塞试管中，再加入2 mL DPPH溶液，于30 ℃恒温条件下避光反应30 min。反应结束后于517 nm波长下测定吸光度Ai。同等质量浓度的抗坏血酸溶液作为阳性对照(A0为2 mL DPPH+2 mL甲醇的吸光度，Aj为2 mL样品溶液+2 mL甲醇的吸光度)。

(6)

2 结果与分析

2.1 SDF提取的单因素分析

2.1.1最佳料液比的确定

由图1可知，随着料液比的增加，SDF提取率逐渐增加；当料液比(g/mL)大于1:12以后，SDF提取率逐渐下降。这可能是由于随着料液比的增加，单位面积内底物与酶的有效接触面积减少造成的。因此，确定纤维素酶酶解较佳的料液比(g/mL)为1:12。

2.1.2 最佳酶解时间的确定

由图2可知，随着反应时间的增加，SDF提取率逐渐增加，反应时间达6 h以后，其提取率下降。这可能是由于随着反应的进行，产物的生成一定程度上抑制了反应的进行。因此确定最佳反应时间为6 h。

图1 不同料液比对SDF提取率的影响Fig.1 The effect of material to liquid ratio on yield of SDF

图2 不同酶解时间对SDF提取率的影响Fig.2 The effect of enzymolysis time on yield of SDF

2.1.3 纤维素酶最佳添加量的确定

由图3可知，在纤维素酶体积分数为1.0 %的条件下SDF的提取率最高，纤维素酶体积分数继续升高，提取率显著下降。这是因为在纤维素酶体积分数较低时，SDF产量随着纤维素酶的增加而增加；随着纤维素酶增加到一定程度，酶解产物的增加抑制了SDF的降解，SDF 得率逐渐降低。因此，初步确定纤维素酶的最适加入体积分数为1.0% 。

2.1.4 最佳浸提次数的确定

由图4可知，提取率随浸提次数增加而增大，浸提次数超过3次后提取率基本上无变化。

图3 不同纤维素酶体积分数对SDF提取率的影响Fig.3 The effect of cellulase volume fraction on the yield of SDF

图4 浸提次数对SDF提取率的影响Fig.4 The effect ofextraction times on the yield of SDF

2.2 SDF提取的正交试验设计及结果

由表2可知，根据极差大小分析，各因素对SDF提取率的影响次序为：B>A>D>C，即纤维素酶体积分数大于料液比大于提取时间大于浸提次数。最佳提取工艺条件组合为A2B2C3D1，采用此最佳提取工艺，在料液比1:12(g/mL)、纤维素酶体积分数1.2%、提取时间6 h的条件下，SDF的提取率为3.57%，较正交试验中最高浸提率得率3.36%有所提高。

表2 正交试验结果及分析

注：*用SPSS16.0进行方差分析，P<0.05；X1、X2、X3为同一水平提取率的平均值，R为极差。

2.3 忍冬藤SDF性能分析

SDF作为一种膳食纤维，所具有的理化性能是衡量其商品特性的重要指标，影响其保健价值的大小。忍冬藤SDF性能见表3。

表3 忍冬藤SDF性能表

2.3.1 持水力和膨胀力

忍冬藤SDF因其化学结构中含有羟基等亲水基团，能吸收相当于自身质量数倍的水分,因而具有较高的持水力，可增加人体排便的体积和速度[7]，从而减轻直肠内和泌尿系统的压力，对便秘、高血压以及冠心病等有一定的预防和治疗作用。SDF吸水膨胀后，对肠道产生容积作用，易引起饱腹感，对预防肥胖症也大有益处。表3结果显示，忍冬藤SDF的持水力为6.1 g/g，膨胀力为5.3 mL/g，吸水力和膨胀力较好，高于小麦膳食纤维[8]。

2.3.2 持油力

表3结果显示，忍冬藤SDF持油力为4.53 g/g，与芦笋老茎吸附油脂的能力接近，高于米糠膳食纤维的持油力[9]。

2.3.4 阳离子交换能力

膳食纤维的阳离子交换能力是指SDF在水溶液中离解出某些阳离子，通过吸附溶液中原有的阳离子来进行离子交换，从而起到排毒、降血压的生理功效。表3结果显示，忍冬藤SDF的阳离子交换能力为0.58 mmol/g，低于脱脂米糠膳食纤维阳离子交换能力。

2.3.3 DPPH自由基清除率

由图5可知，在测定的质量浓度范围内，忍冬藤SDF对DPPH自由基的清除率随浓度的升高而增大。质量浓度为1 g/L时，清除率为10.09%，最大清除率为80.13%。半数有效浓度(median effective concentration， EC50)低于10 g/L，表明其具有很好的抗氧化活性[10]。

图5 DPPH自由基清除能力Fig.5 The DPPH Free radical scavenging capacity of SDF

3 讨论

生物酶在各种动植物中大量存在，是一种天然物质，生物酶的作用条件温和，经济、环保且提取率高，在天然产物的提取中备受青睐。本研究利用淀粉酶和糖化酶除去淀粉，然后调节pH，在碱性环境下除去蛋白质，可加速蛋白质碱解完全，利用纤维素酶提取膳食纤维，更加高效安全。通过单因素试验和正交试验分析，影响忍冬藤中SDF提取率的因素依次为纤维素酶体积分数大于料液比大于提取时间大于浸提次数。最佳工艺条件为pH=4.8，温度45 ℃，料液比1:12(g/mL)，纤维素酶体积分数1.2%，提取时间6 h，在此条件下，SDF的提取率为3.57%。

膳食纤维资源开发的来源多种多样，谷物、豆类、水产、蔬菜和水果等均可提取膳食纤维[11]，其优良的理化性质可改善加工产品的品质，并有较好的保健功能，燕麦、魔芋、菊苣、苹果以及甜菜等中的SDF已实现工业化生产。忍冬藤SDF较高的持水力和膨胀力可以提高面团的蓬松度，改善面粉品质。持油力、阳离子交换能力和DPPH自由基最大清除率都表明其保健价值较高。尤其是忍冬藤SDF具有的抗氧化性，是目前膳食纤维开发的热点方向，较高的抗氧化性与其自身具有的抗氧化性物质如有机酚酸类成分密不可分[12]。该研究可以丰富膳食纤维来源，提高忍冬的综合利用价值，有利于促进金银花药材的产业发展。

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DOI:10.3976/j.issn.1002-4026.2017.01.005

Extraction and property analysis of soluble dietary fiber from stems ofLonicerajaponica

GUO Feng-qian, HUANG Zu-shun, ZHU Bao-lei, LIU Qian*

(Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250355, China)

∶The optimal technology of extracting soluble dietary fiber (SDF) from stems ofLonicerajaponicaby cellulose method was investigated and the properties of SDF were also analyzed. Based on single-factor experiments, orthogonal experiments were performed to optimize the extractive conditions, and the results showed the optimum conditions were pH 4.8, at 45 ℃, 1∶12(g/mL)of material and water, cellulase 1.2% by volume, extracting for 6 h, 3 times.Under the above conditions, the yield of SDF was 3.57%, whose water holding capacity was 6.1 g/g, expansion force was 5.3 mL/g, oil holding capacity was 4.53 g/g, cation exchange capacity was 0.58 mmol/g, highest free radical scavenging rate on DPPH was 80.13%, and the SDF had excellent physical and chemical properties. The study indicated that the cellulose method can be used to extracting SDF from stems ofLonicerajaponica.

∶ stems ofLonicerajaponica; water soluble dietary fiber; cellulase; properties

10.3976/j.issn.1002-4026.2017.01.004

2016-04-26

山东省科技发展计划(2014GSF11903)；2015年度大学生研究训练计划(SRT)(201510441023)

郭凤倩(1993—)，女，研究方向为中药资源与质量控制。

*通信作者，刘谦(1982—)，女，讲师，研究方向为中药资源与质量控制。

R284.2

A

1002-4026(2017)02-0020-06