细胞内外钙在激动剂收缩结肠平滑肌中的作用

周 华，李 华，张 敏，张 晟，张 平，姜文涛

(安徽医学高等专科学校基础部生理教研室，安徽 合肥 230601)

·实验研究·

细胞内外钙在激动剂收缩结肠平滑肌中的作用

周 华，李 华，张 敏，张 晟，张 平，姜文涛

(安徽医学高等专科学校基础部生理教研室，安徽 合肥 230601)

目的探讨结肠平滑肌收缩效应与细胞内外钙离子的关系。方法观察有钙和无钙环境中，结肠平滑肌的收缩效应。同时用M受体阻断剂阿托品阻断受体作用，建立store-operated钙通道，并研究其对结肠平滑肌收缩效应的影响。结果（1）无论是有钙液中还是无钙液中激动剂均引起结肠平滑肌收缩，在有钙液内激动剂的作用更大；（2）神经递质ACh诱导的结肠平滑肌收缩反应中，有store-operated钙通道介导的Ca2+内流参与。结论激动剂诱导的结肠平滑肌收缩反应中，细胞内外钙均有作用，而且胞内钙库耗竭激活的store-operated钙通道也参与了收缩反应。

大鼠，结肠，钙，store-operated钙通道

钙离子是细胞内重要的第二信使，它参与调节机体多种生命活动过程，如：神经传导、肌肉收缩等。众所周知，胞浆内Ca2+浓度的变化是启动平滑肌兴奋-收缩耦联的核心[1]，而胞浆内Ca2+主要来源于两个方面：细胞内钙的释放和细

胞外钙的进入。在血管平滑肌上研究钙信号用以对抗高血压已得到广泛开展，但对消化道平滑肌的研究相对较少。众所周知，消化系统的消化功能与消化道的运动关系密切，消化道的运动即依赖消化道平滑肌的收缩，而Ca2+是触发消化道平滑肌肌丝滑行的关键性因素。而胞内Ca2+的来源无非是细胞内钙的释放及细胞外钙的进入。目前推测，消化系统炎症疾病的病理性变化可能与细胞内Ca2+信号紊乱有关，最终引起消化道平滑肌收缩性降低。本研究旨在讨论细胞内外钙与激动剂引起的大鼠结肠平滑肌收缩之间的关系，并对其作用机制进行了分析，以期为临床治疗提供新的依据，为新型药物的开发提供新的靶点。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物与试剂

SD大鼠（安徽医科大学实验动物中心）；乙酰胆碱（Acetylcholine，ACh）、阿托品（atropine）、维拉帕米（verapamil）、EGTA、DMSO均购自美国Sigma公司。Krebs液组成如下（mmol/L）：NaCl 114.0，KCl 4.7，MgCl21.2，CaCl22.5 NaH2PO41.8，Glucose 11.5，NaHCO318.0，pH 7.4±0.5；无钙Krebs液为正常Krebs液去除CaCl2，其它成分不变。

1.1.2 仪器

JZ-100肌肉张力换能器、HSS-1数字式超级恒温浴槽（成都仪器厂），Powerlab生物信号采集处理系统（Australia AD Instruments）。

1.2 实验方法

1.2.1 张力测定

健康SD大鼠，150～250 g，雌雄不拘。实验前禁食18 h，颈椎脱臼处死，迅速从直肠上方4 cm处取出结肠肠段（约2 cm），置于Krebs液中。用组织剪剪去周围组织，清除肠内容物，并去除肠管内皮层。将标本置37℃Krebs液浴槽内，通O2，调静息张力为1 g。张力大小通过张力换能器输入Powerlab数据采集处理系统进行记录。标本均在浴槽内平衡1 h后开始实验。所示的药物浓度均为投入浴槽液中的终浓度。

1.2.2 实验分组

激动剂-经典神经递质ACh对离体大鼠结肠肠段收缩效应观察分为三组：ACh组（对照组），细胞外液无钙组，细胞外钙恢复组。ACh组：即向置于有钙Krebs液的结肠肠段，投入ACh 5µmol/L；细胞外液无钙组：待ACh诱导的结肠收缩反应稳定后，分别用无钙Krebs液冲洗肠管（0Ca组）或向浴槽中加入EGTA（+EGTA组）以去除细胞外液中的钙；细胞外钙恢复组：即再次向细胞外液中恢复Ca2+2.5 mmol/L。

1.3 统计学方法

实验数据采用SPSS 13.0统计处理，数据用均数±标准差表示，统计学处理采用配对t检验，P＜0.05被认为有统计学意义。

2 结 果

2.1 细胞外钙对激动剂诱导的结肠平滑肌收缩的必要性

与对照组相比，0Ca组和+EGTA组，ACh诱导的结肠收缩反应明显降低，恢复胞外Ca2+后，张力大小又逐渐恢复（n=12，P＜0.001）。0Ca组中，张力（g）大小分别为：1.48±0.78，0.62±0.15，0.94±0.27；+EGTA组中，张力（g）大小分别为：1.44±0.40，0.72±0.18，1.54±0.26。

2.2 store-operated钙通道与结肠平滑肌收缩

向无钙Krebs液中的标本加入ACh 5 µmol/L，结肠迅速短暂收缩，该收缩依赖细胞内贮存钙的释放，收缩反应稳定后，再加入M受体阻断剂atropine10 µmol/L（阻断受体的作用），在此基础上恢复细胞外 Ca2+至2.5 mmol/L，结肠出现持续性收缩，该收缩依赖store-operated钙通道介导的胞外钙内流。统计学结果显示，细胞内钙介导的收缩张力约（1.70±0.15）g，store-operated钙通道介导的胞外钙内流引起的收缩张力约（0.83±0.45）g，内钙释放介导的收缩张力约是胞外钙内流介导的收缩张力的2.1倍。

3 讨 论

溃疡性结肠炎是一种病因未明的结肠和直肠慢性非特异性炎症性疾病，病程漫长，常反复发作，给人类的生活带来极大的困扰。临床研究表现，溃疡性结肠炎的病人，排便习惯发生改变，常见腹泻。经证实，患者炎症部位的平滑肌动力下降，使得结肠中食糜进行性往返运动的节段减少，加重腹泻。而Ca2+在平滑肌运动中起重要作用，细胞内钙稳态是维持其正常收缩和舒张的基础，钙稳态失衡可导致平滑肌收缩性改变，是许多疾病的病理生理学基础。本实验观察了有Ca2+和无Ca2+条件下ACh对大鼠离体结肠平滑肌的收缩效应，以观察神经递质对结肠平滑肌收缩的机制，为临床治疗提供新的依据。

目前，对于store-operated钙通道的激活又有了新的认识，可能与STM1和Orai1两种蛋白有关。STM1位于SR/ER膜上，可以探测SR/ER内贮存的Ca2+的浓度，当贮存的Ca2+减少或耗竭时，STM1涌向ER/SR连合处，在那里它们直接与Orai1蛋白相互作用，并发送信号至Orai1蛋白，随后通道打开介导Ca2+内流。因此，STM1和Orai1两种蛋白被认为是组成store-operated钙通道的最基本的功能单位。至于STM1和Orai1两种蛋白是否会导致大鼠结肠平滑肌钙稳态失衡而引起动力紊乱，尚需进一步探讨。

[1] David C. Hill-Eubanks1, Matthias E. Werner2, et al.Calcium Signaling in Smooth Muscle[J].Cold Spring Harb Perspect Biol,2011,3(a004549):1-20.

本文编辑：王雨辰

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ISSN.2095-8242.2017.08.1398.02

2013年高校省级优秀青年人才基金重点项目：结肠SOC通道分子实质及该通道对肠道炎症调控研究（2013SQRL118ZD）