藤茶总黄酮和二氢杨梅素含量研究

杨志坚，温杭凯，陈选阳，徐惠龙，刘江洪，吴仁烨，许 明，廖素凤，郑金贵*

(1.福建农林大学作物遗传育种与综合利用教育部重点实验室，福建农林大学农产品品质研究所 350002； 2.福建中医药大学药学院)

藤茶学名为显齿蛇葡萄[Ampelopsisgrossedentata(Hand-Mazz) W.T.Wang],俗称莓茶、端午茶、藤婆茶等，为葡萄科蛇葡萄属植物[1]，主要分布于我国广东、云南、江西、福建等地[2]。藤茶为我国特有的药食两用植物[3]。藤茶中二氢杨梅素含量约为3.8 mg/g[4]；藤茶水浸物中含有丰富的多糖和氨基酸[6]，包含8种人体必需氨基酸，具有营养保健、提高免疫力等功效；藤茶含有大量的多酚和黄酮类化合物，科学研究表明，黄酮具有杀菌消炎、止咳镇痛、保肝护肝、降糖降脂等功效[7]。因此，藤茶具有一定的医疗保健功效。目前关于藤茶的研究主要集中在藤茶活性成分的分离鉴定及黄酮的抗菌、抗氧化、降血糖等方面[5]。

总黄酮是一类在植物界中分布广泛，具有多种生物活性的多酚类化合物。国内主要以紫外分光光度法检测藤茶总黄酮，此外还有ZrOCl2·8H2O显色法、AlCl3显色法、荧光检测法和直接检测法[12]。

二氢杨梅素是一种多酚羟基双氢黄酮醇，又称蛇葡萄素，属于黄酮类化合物。高效液相色谱法具有分离速度快、效率高、精密度和准确度较高等优点，在国内广泛运用于二氢杨梅素的检测，此外藤茶二氢杨梅素的检测方法还有薄层扫描法、紫外分光光度法[12]。

1 材料与方法

1.1 试验仪器与材料

KQ-700E型超声波清洗器、紫外-可见分光光度计、waters高效液相色谱仪。

甲醇为色谱纯(Fisher公司)，5%NaNO2溶液、10%AlCl3溶液、4% NaOH溶液，蒸馏水为娃哈哈纯净水。

3个藤茶品种分别来自湖南郴州的AG1、湖南湘潭的AG2、福建武夷山的AG3，样品取自2014年7月采摘的藤茶，除不同加工方式中采用晒干及热风干燥外，其余试验均采用热风干燥。对不同器官(藤茶根、藤茶叶片、藤茶花、藤茶叶柄、藤茶茎)研磨过20目筛，然后取样分析。

1.2 测定方法

1.2.1总黄酮含量的测定 采用NaNO2-Al(NO3)3比色法，利用超声波等仪器，以亚硝酸钠—氯化铝—氢氧化钠作为显色体系，根据分光光度计法测定植物体内化合物的原理，提取藤茶中的总黄酮及其化合物[8]。以亚硝酸钠—氯化铝—氢氧化钠作为显色体系对藤茶中总黄酮含量进行测定，使用分光光度计测定其吸光度，测定波长500 nm，然后根据标准曲线计算出相应的样品总黄酮含量。准确称取样品0.05 g，加入提取剂甲醇10 mL，40℃超声30 min充分混匀；将浸泡液避光置于室温保存12 h，8000 r/min离心15 min，取上清液定容至10 mL；用紫外可见分光光度计测500 nm处的吸光值，3次重复取平均值。准确量取提取液3 mL于25 mL容量瓶，按标准曲线的操作步骤，分别加入5%NaNO2溶液1 mL，摇匀；6 min后加入10% AlCl3溶液1 mL，摇匀；6 min后加入4%氢氧化钠溶液10 mL，摇匀；以蒸馏水定容，摇匀，静置15 min，以蒸馏水代替样品作为对照，在紫外可见分光光度计上测500 nm处的吸光值，3次重复取平均值。通过回归方程计算出总黄酮含量(x)，样品总黄酮含量以样品干重的百分数计：总黄酮=x×10×25/3×0.001×100/w

式中：x-从标准曲线计算出的总黄酮含量(mg/mL)；10-提取剂的体积(mL)；25/3-提取剂的稀释倍数；0.001-毫克换算为克；w-所称取藤茶样品粉末的质量(g)。

1.2.2二氢杨梅素含量的测定 取样并研磨，用100%甲醇(AR)溶液在60℃水浴超声提取，测定用C18，检测波长290 nm、HPLC分析，用二氢杨梅素标准物质外标法直接测定[9]。液相色谱流动相(AB相相同)水∶甲醇∶磷酸为75∶25∶0.1，定容后溶液需过0.45 μm膜，超声脱气。标准工作溶液用色谱甲醇配制(标准工作溶液浓度为0.01 g/mL)。称取0.1000 g(精确到0.0001 g)均匀研磨的试样于50 mL锥形瓶中，加入100%甲醇溶液50 mL，立即移入60℃的超声仪中，超声30 min，浸提后冷却至室温，转入50 mL容量瓶中用100%甲醇定容、摇匀。取10 mL至离心管，在3500 r/min转速下离心10 min(20℃或15℃)；取上清液1 mL至10 mL容量瓶中用100%甲醇定容、摇匀，取1.5 mL过0.45 μm膜，待测。在色谱条件流动相流速为0.7 mL/min，柱温为30℃，紫外检测器波长290 nm，洗脱条件为100%A 或100%B相保持20 min。待流速和柱温稳定后，进行空白运行(进空针)。准确吸取10 μL标准工作液注射入HPLC。在相同的色谱条件下注射10 μL测定液，测试液以峰面积定量。

2 结果与分析

2.1 藤茶不同器官总黄酮含量

藤茶不同器官总黄酮含量测定结果见表1。由表1看出，3个藤茶品种不同器官的总黄酮含量存在差异，总黄酮含量由高到低顺序为根、叶、花、叶柄、茎，3个藤茶品种根的总黄酮平均含量为235.03 mg/g；藤茶总黄酮含量最高的品种是AG 1，除叶柄外的其他器官总黄酮含量均高于其他2个品种。

表1 藤茶不同器官总黄酮含量 (单位： mg/g)

2.2 不同加工方式对藤茶叶片总黄酮含量的影响

由表2看出，3个藤茶品种叶片总黄酮含量均是晒干方式高于热风烘干方式，采用晒干方式的总黄酮平均含量为212.74 mg/g，是采用热风烘干方式(192.82 mg/g)的1.1倍。

表2 不同加工方式藤茶叶片总黄酮含量 (单位： mg/g)

2.3 不同存放时间藤茶叶片总黄酮含量变化

由表3看出，3个藤茶品种叶片总黄酮含量存在一定差异，且均随着存放时间的延长，总黄酮含量降低，3个品种叶片平均总黄酮含量存放1年为192.82 mg/g，存放3年为128.31 mg/g，降低了33.5%。

表3 不同存放时间藤茶叶片总黄酮含量 (单位： mg/g)

2.4 藤茶不同器官二氢杨梅素含量

由表4看出，3个品种的藤茶不同器官二氢杨梅素含量由高到低的顺序均是花、叶柄、根、茎，其中以AG 3品种的藤茶叶片二氢杨梅素含量最高，达到3.99 mg/g；3个藤茶品种的茎均未检测到二氢杨梅素。

表4 藤茶不同器官二氢杨梅含量 (单位：mg/g)

2.5 不同加工方式对二氢杨梅素含量的影响

不同加工方式(烘干、晒干)处理的藤茶二氢杨梅素含量的检测结果见表5。由表5看出，品种间的二氢杨梅素素差异不大；不同加工方式3个藤茶品种二氢杨梅素含量存在一定的差异，均是采用晒干加工方式高于热风烘干方式，采用晒干方式加工藤茶的二氢杨梅素平均含量为4.72 mg/g，是采用热风烘干方式(3.93 mg/g)的1.2倍。

表5 不同加工方式藤茶二氢杨梅素含量 (单位： mg/g)

2.6 不同存放时间对二氢杨梅素含量的影响

不同存放时间(存放1年、存放2年、存放3年)处理的藤茶二氢杨梅素含量检测结果见表6。由表6看出，品种间差异不明显，但不同存放时间对3个藤茶品种二氢杨梅素含量存在明显的影响：不同存放时间藤茶二氢杨梅素含量由高到低均为存放2年、存放1年、存放3年，存放2年的藤茶二氢杨毒素含量最高，平均含量达到14.42 mg/g，是存放3年的13.87倍。

表6 不同存放时间藤茶二氢杨梅素含量 (单位：mg/g)

3 结论与讨论

3.1 藤茶不同器官总黄酮与二氢杨梅素含量

3个藤茶品种不同器官总黄酮平均含量由高到低为根、叶片、花、叶柄、茎，二氢杨梅素平均含量由高到低为叶、花、叶柄、根、茎，二氢杨梅素在总黄酮中比例最高的部位为叶片(2.04%)。总黄酮为藤茶的主要活性物质，总黄酮含量最高的根部二氢杨梅素含量未必最高。二氢杨梅素在25℃水中溶解度为4%，热水中的溶解度更大，易溶于乙醇及丙酮，极微溶于醋酸乙酯[11]。总黄酮与二氢杨梅素在藤茶器官中分布情况不一致，可能是由于总黄酮在根部合成，导致根部含量较高，运输到叶片后发生化学反应，生成二氢杨梅素，导致叶片二氢杨梅素含量较高。

3.2 不同加工方式藤茶总黄酮与二氢杨梅素含量

不同的加工方式对3个藤茶品种总黄酮和二氢杨梅素含量都有一定的影响，采用晒干加工方式总黄酮和二氢杨梅素的含量均高于烘干的加工方式。究其原因：晒干的过程中，由于温度不高，叶片仍然可在光合作用下进行一系列的化学反应，造成更多的二氢杨梅素生成。

3.3 不同存放时间藤茶总黄酮与二氢杨梅素含量

不同存放时间的总黄酮与二氢杨梅素平均含量存在一定差异，不同存放时间藤茶总黄酮平均含量由高到低顺序为存放1年、存放2年、存放3年；而二氢杨梅素平均含量由高到低顺序为存放2年、存放1年、存放3年。究其原因：可能是因为在藤茶叶存放过程中总黄酮一直处于分解过程，导致含量逐渐降低。存放初期总黄酮向二氢杨梅素转化分解，导致二氢杨梅素含量升高，但随着时间的延长，总黄酮含量降低，二氢杨梅素转化量减少，同时二氢杨梅素分解量逐渐增加，导致二氢杨梅素含量在存放第3年明显降低。

不同的器官、处理方式及存放时间对藤茶二氢杨梅素总黄酮含量均有影响，在实际生产中应探讨不同因素对藤茶品质的影响，并加强调控，从而提高藤茶总黄酮和二氢杨梅素的含量，为食品、药品的开发提供更有效的原料。

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