固相萃取-高效液相色谱-串联质谱法测定植物源食品中嗪氨灵的残留量

王 敬,马育松,*,赵中辉,代汉慧,张海超

(1.河北出入境检验检疫局,河北石家庄 050051;2.中国出入境检验检疫协会,北京 100029;3.中国检验检疫科学研究院,北京 100123)

固相萃取-高效液相色谱-串联质谱法测定植物源食品中嗪氨灵的残留量

王 敬1,马育松1,*,赵中辉2,代汉慧3,张海超1

(1.河北出入境检验检疫局,河北石家庄 050051;2.中国出入境检验检疫协会,北京 100029;3.中国检验检疫科学研究院,北京 100123)

建立了固相萃取-液相色谱-串联质谱测定植物源食品(大米、大豆、菠菜、番茄、辣椒、蘑菇等)中嗪氨灵残留量的检测方法。试样用乙腈均质提取,采用石墨化碳黑/氨基柱(ENVI-Carb/NH2)净化后,用多反应监测(MRM)正离子扫描方式进行检测,外标法定量。结果表明,嗪氨灵在2～1000 ng/mL范围内呈线性关系良好,方法的检出限(S/N=3)为0.5～1.5 μg/kg,定量限(S/N=10)为1.6～4.9 μg/kg,加标平均回收率范围为68.4%～109.0%,相对标准偏差(RSD)为4.38%～13.5%。方法的选择性好,抗干扰能力强,能满足国内外法规的要求,可以为植物源食品中嗪氨灵残留的检测提供技术支持。

高效液相色谱-串联质谱,嗪氨灵,固相萃取,植物源食品

嗪氨灵是一种酰胺类内吸杀菌剂,广泛用于对粮谷、果树和蔬菜中白粉病、锈病和黑星病的防治。由于它能够破坏动物体内的血红细胞,许多国家对它的最高残留限量都有严格规定[1]:欧盟已严格制定了505种食品中嗪氨灵的最大残留量,且最为严苛,范围为0.01～0.05 mg/kg;日本规定了193种食品中嗪氨灵的最大残留量;我国GB 2763-2014《食品安全国家标准食品中农药最大残留限量》则仅仅规定了17种食品中嗪氨灵的限量要求,无论是涉及的样品种类,还是残留指标数都远低于发达国家和国际组织,使我国的食品安全问题存在隐患。随着各国贸易技术措施的不断加严,检测基质种类的大大增加,目前的检测方法已无法满足近70%的欧盟最高限量要求。

目前,国内外研究集中在大米、黄瓜、西瓜[2-5]较为简单的基质,对蔬菜、豆类、食用菌样品的研究未见报道。检测方法主要有气相色谱法、高效液相色谱法、液相色谱-质谱法等。采用气相色谱法的前处理较为繁琐,需要对样品进行衍生化处理,耗时长且易出现假阳性结果;高效液相色谱法和液相色谱-质谱法灵敏度低,选择性和特异性较差,已无法满足检测工作需要[2]。本文参考国内外文献方法,对样品的提取及净化进行了优化,根据国内外对嗪氨灵残留量的要求,选择了几种有代表性的基质如粮谷、豆类、水果、蔬菜和食用菌等作为检测对象,采用液相色谱-串联质谱法作为分析手段,建立了植物源食品中嗪氨灵残留量的检测方法,方法简单快速、灵敏度高,能够满足国际上日益严格的农药残留量的检测要求。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

嗪氨灵(分子式为C10H14Cl6N4O2,CAS No. 26644-46-2,纯度≥99%) 德国Dr. Ehrenstorfer公司;乙腈、甲酸、丙酮、乙酸乙酯、二氯甲烷 色谱纯，美国Sigma公司;甲苯、无水硫酸钠和氯化钠 分析纯，北京化学试剂公司;PSA固相萃取柱(1000 mg,6 mL)、石墨化炭黑/氨基固相萃取柱(500 mg/500 mg,6 mL)、石墨化碳黑固相萃取柱(1000 mg,6 mL) 美国Supelco公司;C18固相萃取柱(1000 mg,6 mL)、QuEChERS提取管(内含1.5 g无水硫酸钠和6 g无水硫酸镁)、QuEChERS净化管(内含150 mg无水硫酸钠镁,50 mg PSA,50 mg C18) 美国Waters公司;J2 Scientific MPS GPC(装有22 g S-X3 Bio-Beads填料,粒径38～75 μm) 美国J2 Scientific公司;实验用水 超纯水。

Thermo TSQ Quantum Ultra液相色谱-串联质谱仪(配电喷雾离子源) 美国Thermo Fisher公司;旋转蒸发器 德国Heidolph公司;PT 3100型均质器 瑞士Kinematica公司;Turbo Vap LV型氮吹浓缩仪 美国Zymark公司;ML 204/02分析天平 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;CR22GIII型高速冷冻离心机 日本HITACHI公司;固相萃取柱装置 美国Waters公司;Milli-Q纯化系统 美国Millipore公司。

1.2 标准溶液的配制

1.2.1 标准储备液 精密称取嗪氨灵标准品10 mg置于10 mL容量瓶中,用乙腈溶解并定容,配制成质量浓度为1000 mg/L的标准储备液,置于棕色试剂瓶中,4 ℃避光保存。

1.2.2 标准工作溶液 准确吸取适量标准储备液,用乙腈配制成系列标准工作溶液,现用现配。

1.2.3 辣椒和蘑菇基质空白标准工作溶液 准确吸取适量标准储备液,用辣椒和蘑菇样品空白提取液(由1.3步骤所得)配制成系列基质空白标准溶液,现用现配。

1.3 样品前处理方法

1.3.1 提取 苹果、葡萄、菠菜、番茄、甘蓝、黄瓜和蘑菇:称取试样约4 g(精确到0.01 g)于50 mL离心管中,加入5 g氯化钠(既可以促使有机相与水相分层,降低待测物在水相中的溶解度,又可在均质过程中起到研磨的作用,提高提取效率),20 mL乙腈,15000 r/min均质提取2 min,4000 r/min离心10 min,将上清液经装有10 g无水硫酸钠的漏斗过滤至120 mL鸡心瓶中。再用20 mL乙腈重复提取1次,合并提取液于同一鸡心瓶中,于45 ℃水浴浓缩至近干,待净化。

大米、玉米、小麦、大豆和辣椒:称取试样约4 g(精确到0.01 g)于50 mL离心管中,加10 mL水润湿样品,混匀2 min,静置30 min后处理方法与苹果、葡萄等样品相同[6]。

1.3.2 净化 用2 mL乙腈-甲苯(7+3,V/V)溶解上述步骤中所获得的浓缩液,过石墨化炭黑/氨基固相萃取柱(使用前用10 mL乙腈-甲苯(7+3,V/V)预淋洗),再用3 mL乙腈-甲苯(7+3,V/V)溶液分3次洗脱,控制流速为0.5 mL/min,收集全部流出液,于45 ℃氮气吹干。用1.0 mL乙腈溶解,过0.22 μm有机相微孔滤膜后,待测。

1.4 仪器条件

色谱柱:Thermo Hyperisil GOLD C18色谱柱(100 mm×2.1 mm,5 μm);进样量:10 μL;柱温:30 ℃;流动相:A相为0.2%甲酸水溶液,B相为乙腈;流速:300 μL/min;梯度洗脱程序如下:0～4.0 min,15% B～85% B;4.0～7.0 min,85% B;7.0～7.01 min,85% B～15% B;7.01～10.0 min,15% B。

电离方式:电喷雾正离子源(ESI+);检测模式:MRM;毛细管电压:3.5 kV;离子源温度:150 ℃;去溶剂温度:350 ℃;鞘气(N2)压力:241.3 kPa;辅助气(N2)压力:55.1 kPa;定量离子对435.0>389.8(碰撞能量:22 V),定性离子对435.0>214.9(碰撞能量:25 V)。

2 结果与讨论

2.1 提取溶液的优化

分别以丙酮、乙腈、乙酸乙酯、乙腈-乙酸乙酯和二氯甲烷作为提取溶剂进行筛选。结果发现,用丙酮和乙酸乙酯提取时,溶出的样品杂质、油脂较多;而用二氯甲烷提取时,提取液在下层,不便于操作,且提取过程中容易乳化;用乙腈提取不仅能沉淀蛋白质而且脂肪提出物和溶出杂质很少,有利于后续的盐析和净化,另外操作过程相对简单,提取效率高。实验选取乙腈作为提取溶剂对添加嗪氨灵的样品进行提取后,回收率可达98%以上。由于嗪氨灵水溶性强,粮谷、辣椒等较干的样品直接用乙腈提取,回收率受很大的影响。实验发现,大米、玉米、小麦、大豆和辣椒等样品在采用有机溶剂提取前加入少量水浸泡30 min,提取效率能够提高12%～20%。

2.2 固相萃取柱的选择

实验选取了PSA、C18、石墨化碳黑、凝胶渗透色谱(GPC)、中性氧化铝-活性炭组合柱、QuEChERS和ENVI-Carb/氨基柱等进行了比较。结果发现:PSA、C18和石墨化碳黑柱的净化效果有限,仍会有大量干扰存在,基质效应明显,嗪氨灵的平均回收率均小于60%;QuEChERS法是直接把填料加入提取液中进行吸附净化,去除干扰物质的能力较差,平均回收率为65%;凝胶渗透色谱(GPC)虽然自动化程度高,但对于单组分研究目标物收集时间较长,溶剂使用量较大;中性氧化铝-活性炭组合柱需要经过大量实验进行调整、装填、测试及再调整,需要消耗大量的时间,且溶剂使用量较大;ENVI-Carb/氨基柱对含部分脂肪和脂溶性杂质的样品净化较好,ENVI-Carb能很好地吸附天然产物中的色素及固醇类等系列化合物,对于各种极性的分析物,具有更广泛的保留范围并容易洗脱,可以改善多种残留分析结果;氨基柱是弱的阴离子吸附柱,能出色地分离结构异构体,并且对于样品中的一些强极性杂质、有机酸、色素和金属离子(与金属离子产生配合作用)等具有良好的净化效果[7-8],通过固相萃取柱后,嗪氨灵的平均回收率在90%以上,从而起到净化的效果。

实验首先比较了两种常用的洗脱溶剂甲醇-二氯甲烷(1∶99,V/V)和乙腈-甲苯(7∶3,V/V)的净化效果,发现后者洗脱体积小、回收率高且干扰较小,因此选用乙腈-甲苯进行洗脱。在此基础上,选用乙腈作为洗脱剂,讨论了不同体积甲苯(0、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%和40%)调节洗脱强度,确定洗脱液中甲苯最佳比例,结果列于表1。

表1 不同洗脱液比较Table 1 Comparison of different elution solutions

结果发现,在洗脱剂体积不变的条件下,随着甲苯浓度的增加,使用30%甲苯-乙腈溶液进行洗脱时,洗脱效果最佳,回收率最高且峰面积响应值最好。因此,选用乙腈-甲苯(7∶3,V/V)作为洗脱剂。

在洗脱体积的选择上,分别用1、2、5、8、10 mL混合液进行洗脱并收集,得到相应的洗脱体积对回收率的影响如图1所示。

图1 洗脱体积对回收率的影响Fig.1 Effects of eluent volume on the recovery

结果发现,回收率随着洗脱剂的体积增加而增加,当体积达到5 mL后,继续增加洗脱液对回收率的影响不大。

2.3 仪器条件的优化

采用电喷雾离子源,以1 μg/mL的嗪氨灵标准溶液用蠕动泵以流动注射的方式对比正负离子模式。结果表明,嗪氨灵在正离子模式下形成[M+H]+的准分子离子峰,相应较高。选择准分子离子435作为母离子,施加碰撞能对母离子打碎得到二级质谱图,选择丰度较高的两个碎片离子m/z 389.8和214.9作为子离子,其中响应较高的碎片m/z 389.8作为定量离子。对碰撞能力进行优化使各子离子响应最高,二者的碰撞能量分别为22 eV和25 eV。在色谱条件和化合物质谱参数确定的情况下,不接色谱柱对离子源温度、去溶剂气温度及流量、锥孔气流量、射频透镜电压、碰撞气能量等参数进行了优化,使嗪氨灵的响应最高,最佳参数见1.4。嗪氨灵的碎片离子质谱图和多反应监测(MRM)色谱图见图2。

图2 嗪氨灵的碎片离子质谱图和多反应监测(MRM)色谱图Fig.2 Product ion mass spectrum and MRMchromatograms of triforine standard注：a：嗪氨灵的碎片离子质谱图;b：嗪氨灵的多反应监测(MRM)色谱图。

2.4 基质效应

基质效应(Matrix effects,ME)是指色谱分离时共洗脱的物质改变了待测成分的离子化效应,所引起的信号抑制或提高。基质效应影响大时,会降低方法的灵敏度和影响方法的准确性,给测定带来误差。因此,液相色谱-质谱方法开发和确证过程中需要对基质效应做出评价。本文通过配制标准工作曲线和基质匹配校正曲线,以峰面积为纵坐标,质量浓度为横坐标作图,以基质匹配校正曲线和标准曲线斜率的比值来考察化合物的基质效应。一般认为,基质匹配校正曲线斜率与标准曲线斜率的比值在85%～115%之间不存在基质效应[9-12]。

图3表明,对于大米和玉米等10种样品,基质匹配校正曲线斜率为标准曲线斜率的85.9%～114.7%,不存在基质效应;而对于蘑菇、辣椒样品,基质匹配校正曲线斜率分别为标准曲线斜率的44.2%和37.6%,存在明显的基质抑制作用,可能是由于基质中某些干扰组分的存在会使生成的待测组分信号响应值有差异。因此,辣椒和蘑菇样品测定时采用基质匹配溶液进行校正,其它样品采用溶剂标准工作曲线进行校正。

表2 嗪氨灵平均回收率范围及精密度(n=10)Table 2 Average recovery ranges and RSDs(n=10)of triforine

图3 不同样品中嗪氨灵的基质效应Fig.3 Matrix effect of triforine in different matrices

2.5 方法的线性范围、检出限和定量限

对于蘑菇和辣椒样品,分别在空白提取液中准确添加适量的标准溶液,配制成一系列不同浓度2、5、20、50、100、200、500、1000 ng/mL的基质标准溶液,大米、苹果等其它10种基质配制成一系列不同浓度2、5、20、50、100、200、500、1000 ng/mL的溶剂标准溶液,按照相应的仪器工作条件测定。以峰面积(Y)对质量浓度(X)作校正曲线,得到线性范围、线性回归方程及相关系数。结果表明:溶剂校准的线性回归方程为Y=9.7×104X+5.0×105,线性相关系数为0.9997;蘑菇和辣椒基质溶液校准的线性回归方程分别为Y=4.3×104X+1.3×105和Y=1.3×104X+2.3×105,线性相关系数分别为0.9993和0.9991。以3倍信噪比为检出限,10倍信噪比为定量限,分别计算出嗪氨灵的检出限和定量限,其中蘑菇和辣椒基质中嗪氨灵的检出限分别为1.3 μg/kg和1.5 μg/kg,定量限分别为4.2 μg/kg和4.9 μg/kg;其它基质类型中嗪氨灵的检出限和定量限分别为0.5 μg/kg和1.6 μg/kg。

实验以不含嗪氨灵农药的大米、玉米、小麦、大豆、苹果、葡萄、黄瓜、番茄、甘蓝、菠菜、蘑菇和辣椒为空白样品基质,在不同添加水平上进行加标回收率实验,其结果见表2。

从表2可看出,每个水平重复做10次,测得方法的回收率范围为68.4%～109.0%,相对标准偏差(RSD)为4.38%～13.5%,符合规定的要求。

2.6 实际样品的测定

应用本文建立的方法对市售的40份蔬菜、40份水果和10份粮谷样品进行测定,并对实际样品进行了加标回收测定。结果在1批次菠菜中检出5.6 μg/kg的嗪氨灵,2批次甘蓝和1批次蘑菇中检出嗪氨灵,浓度在6.2～16.7 μg/kg之间,均低于GB 2763-2014《食品安全国家标准食品中农药最大残留限量》的要求。

3 结论

实验建立了固相萃取-液相色谱-串联质谱测定植物源食品中嗪氨灵残留量的方法。样品采用乙腈提取,氯化钠盐析,石墨化碳黑/氨基固相萃取法进行净化,同时利用质谱的高选择性,实现了对粮谷、豆类、水果、蔬菜和食用菌等12种植物源食品中的嗪氨灵的定性定量分析,加标回收率范围为68.4%～109.0%,相对标准偏差为4.38%～13.5%,方法的检出限为0.5～1.5 μg/kg,定量限为1.6～4.9 μg/kg,均低于目前文献所报道的方法(潘建伟等[1]测得水果蔬菜中嗪氨灵为0.02 mg/kg;陈武瑛等[3]测得西瓜中嗪氨灵为20 μg/kg;SN 0695-1997[13]测得大米中嗪氨灵为0.02 mg/kg)。该方法分析时间短、灵敏度高、准确度好等优点,可用于植物源食品中嗪氨灵残留的日常检测。

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Determination of triforine residues in plant-derived food by solid phase extraction-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry

WANG Jing1,MA Yu-song1,*,ZHAO Zhong-hui2,DAI Han-hui3,ZHANG Hai-chao1

(1.Hebei Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Shijiazhuang 050051,China;2.China Entry-Exit Inspection and Quarantine Association,Beijing 100029,China;3.Chinese Academy of Inspection and Quarantine,Beijing 100123,China)

A method was developed for the simultaneous determination of triforine residue in various plant-derived foods(such as rice,soybean,spinach,tomato,pepper,and mushroom)by solid phase extraction-liquid chromatography-tandem mass spectrometry. The samples were extracted by acetonitrile,cleaned-up with an ENVI-Carb/NH2solid-phase extractor,and determined by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(HPLC-MS/MS)using external standard method with positive polarity mode under multi-reaction monitoring(MRM)scan type. The method showed good linearity in the range from 2 to 1000 ng/mL. The limits of detection(LODs,S/N=3)varies over the range of 0.5 to 1.5 μg/kg,and limits of quantification(LOQs,S/N=10)ranged from 1.6 to 4.9 μg/kg. The average recoveries in different matrices were in the range of 68.4%～109.0%,with relative standard deviations(RSDs)of 4.38%～13.5%. This method was selective without interference and reliable for meeting the requirements of the domestic and international legislation. The method was suitable for triforine determination in plant-derived food.

HPLC-MS/MS;triforine;solid-phase extraction;plant-derived food

2016-05-27

王敬(1983-)，女，硕士研究生，工程师，研究方向：食品安全监测技术，E-mail：wangjingld@126.com。

*通讯作者:马育松(1975-)，男，硕士研究生，高级工程师，研究方向：食品安全检测技术，E-mail：mys1974@126.com。

国家认监委制标项目(2013B393r)；河北检验检疫局科研项目(HE2014K018)。

TS207.3

A

1002-0306(2017)02-0084-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.02.008