肝纤维化发病机制中关于肝窦血管重塑的研究进展

李 昊，陈 晶

哈尔滨医科大学附属第二医院消化内科，黑龙江 哈尔滨 150000

肝纤维化发病机制中关于肝窦血管重塑的研究进展

李 昊，陈 晶

哈尔滨医科大学附属第二医院消化内科，黑龙江 哈尔滨 150000

肝硬化及门脉高压是各种慢性肝病发展的最终阶段，肝纤维化是各种慢性肝损伤组织修复过程中代偿性的病理变化，是肝硬化发生的必经阶段。肝窦是肝脏特殊的微血管系统，肝窦血管重塑在肝纤维化形成之前已经发生，并进一步形成病理性血管，肝窦血管重塑是肝纤维化及门脉高压的重要发病机制之一。本文将重点介绍此过程中涉及的多种重要细胞、分子及肝窦血管重塑的方式。肝窦血管重塑的方式主要有两种:发芽方式和分裂方式。目前认为应深入研究肝窦血管重塑过程中关键的细胞和分子信号通路，找到更多有效的治疗靶点，有望研发出特异性抑制肝窦血管重塑、逆转早期肝纤维化的临床药物。

肝纤维化；发病机制；肝窦血管重塑

在各种慢性肝病肝活检样本中均可发现新生血管的密度增加和促血管生成因子的过度表达[1-2]。肝窦血管重塑在肝硬化及门脉高压形成前早已发生[3]，且与肝纤维化程度直接相关[4]。在多种肝纤维化动物模型上使用具有抑制新生血管形成作用的多靶点药物,如受体酪氨酸激酶抑制剂、索拉非尼或舒尼替尼，均可抑制肝纤维化进程[5-6]。这些说明抑制病理性新生血管形成有助于阻止肝纤维化进程，多种细胞及细胞因子参与肝纤维化血管形成的过程，因此通过促进或抑制某些细胞及细胞因子的作用，可能达到治疗肝纤维化的目的。

1 参与血管重塑的主要细胞

1.1 肝窦内皮细胞 (liver sinusoidal endothelial cell, LSEC)肝内的循环系统由几个离散的单元构成，包括肝动脉、门静脉、中心静脉、肝窦及淋巴管。这些结构中包含的细胞有内皮细胞、平滑肌细胞、外周细胞等，它们以自分泌或旁分泌的方式相互影响。肝窦是特殊的微血管系统，由LSEC构成。LSEC表型独特，不仅有别于肝内其他细胞，且不同于其他器官的内皮细胞，最主要的特点是“窗口化”结构[7]，且肝窦无基底膜，这些特殊的结构有助于血液之间的物质交换。目前在众多肝纤维化的动物实验模型中都发现，在肝纤维化形成之前已经发生了肝窦毛细血管化，主要表现为肝窦管腔侧基底膜的异常沉积和LSEC的去窗孔化。

肝纤维化的程度与LSEC窗口的数量和直径相关。LSEC表面有丰富的脂质层，其中规律地镶嵌着膜蛋白，在内皮细胞表面，窗口分布的区域与脂质浮排分布密集的区域逆相关。例如，旨在揭开从肝细胞损伤到窗口化减少的分子信号通路的相关研究中发现[8]，作用于LSEC的血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)可通过减少丰富的脂质浮排，起到增加窗口化结构的作用。LSEC对邻近细胞也有重要作用，如LSEC诱导的Wnt2和肝细胞生长因子能促进肝细胞增殖，调控肝脏的再生和纤维化。同时，LSEC也是某些细胞外基质(extracellular matrix, ECM) 的重要来源。例如，LSEC能产生Ⅳ型胶原，这一变化可以“启动”肝纤维化过程中的各种细胞因子。LSEC能产生细胞同型纤维连接蛋白来回应损伤。纤维连接蛋白转而强有力地影响肝星状细胞(hepatic stellate cells, HSCs)，刺激HSCs在损伤过程早期被激活。纤维连接蛋白可以刺激HSCs合成内皮素-1 (endothelin-1, ET-1)，目前ET是研究最广泛的缩血管物质之一。研究[9]表明，活化的HSCs是肝纤维化时ET-1的主要来源，也是ET-1作用的主要靶细胞，HSCs上ET受体的数量远超过肝内其他细胞，并以自分泌或旁分泌的方式影响周围的HSCs。ET-1对HSCs的主要作用为促进其收缩、活化等。刺激HSCs收缩是ET-1对HSCs的主要作用且效果强烈，HSCs的收缩可使肝窦血管阻力增加。研究[10]表明，短暂灌注ET-1能引起离体肝脏显著和长时间的门脉压力升高。ET-1促进HSCs活化主要表现在HSCs增殖及平滑肌α肌动蛋白(smooth muscle actin, α-SMA)表达增加，主要通过MAPK通路发挥作用。另外，细胞缺氧会使LSEC线粒体功能衰竭，使维持LSEC窗口化结构的细胞骨架坍塌，发生失窗口化，进一步形成肝窦毛细血管化。

总之，肝纤维化早期，在各种因素的作用下，LSEC表型发生多种变化并分泌多种细胞因子，激活HSCs等一系列细胞，产生级联放大效应，成为肝纤维化初始的触发靶点。

1.2 HSCsHSCs被认为是特殊的外周细胞。外周细胞通常存在小口径的血管周围，特别是毛细血管。它们表现出很多平滑肌细胞的特点，并且被认为有调控血流的作用。最新研究[11-12]提示它们的作用更加复杂，还有其他多向性作用，尤其在损伤修复方面。当前的资料表明在损伤修复过程中，HSCs发生了转化，这个过程称为“激活”，包括形态和功能上大量、复杂、综合的变化。如肌动蛋白束增加、维生素A减少、粗面内质网增加及产生大量的ECM。其中，最显著的特点是α-SMA表达增加。因此也说明HSCs是肝脏特殊的肌成纤维细胞。肌成纤维细胞是很多组织损伤修复时的关键细胞，可以产生大量的细胞外基质和平滑肌蛋白[13]，因此活化后收缩迁移的能力增加。在肝脏中，肌成纤维细胞的功能是导致纤维发生，致使肝内正常结构发生改变，促进病理性血管形成，从而间接增加门脉压力。有说法认为，α-SMA的调控和纤维化之间有平行关系。例如，转化生长因子β1(transforming growth factor-β1, TGF-β1)对HSCs来说是最能够促进纤维化的细胞因子，TGF-β1能促使α-SMA基因的表达[14]。这些资料表明α-SMA并不是静态时细胞骨架的成分，而是HSCs行为和功能的动态调节器。

总之，在各种促血管生成的细胞因子的刺激下，HSCs被激活，并向着新生血管的方向迁移募集，活化的HSCs以其触手状结构围绕血管壁延伸,覆盖肝窦血管,促进血管收缩和持续的肝窦结构变化,使大量的ECM沉积，实现病理性肝窦血管重塑[15]。

HSCs的激活受多种信号传导通路调控，机制极其复杂，如TGF-β1/Smad途径、MAPK通路、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferators-activated receptors γ, PPARγ)途径、瘦素受体介导的信号传导途径、整合素信号传导通路途径、NF-κB信号传导通路等，参与肝纤维化的核心环节。在各个通路中都有多种细胞因子参与，发现更多关键性细胞因子的作用机制，可能为新型抗纤维化药物找到更多的治疗靶点。

1.3 肝枯否细胞 (kupffer cells, KC)KC表面有很多伪足、微绒毛和皱襞，还有许多特异性受体和结合位点,承担起它重要的功能，如识别清除异物、分泌多种细胞因子、参与免疫调节等。KC在肝纤维化血管形成中起重要作用。在各种肝硬化模型中都能发现KC的浸润早于HSCs的激活。KC通过自分泌或旁分泌以级联放大的方式分泌各种细胞因子，如血小板生长因子 (platelet derived growth factor, PDGF)、VEGF、TGF-β和ET等，这些细胞因子可通过激活HSCs，使肝窦收缩、肝窦血管阻力增加。并且，KC还能通过活化如核因子-κB(NF-κB)、激活蛋白-1(AP-1)等核转录因子激活HSCs[16]。基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)是参与细胞外基质降解最重要的酶类之一，肝纤维化时，KC能增加MMPs抑制因子的活性，从而使MMPs mRNA表达减少，使ECM降解减少[17]，促进纤维化形成。

总之，KC通过分泌各种细胞因子从各个方面促进HSCs激活及不平衡的分泌促炎因子和抑炎因子调节ECM生成和降解，参与了肝纤维化的各个阶段且作用复杂，以KC的信号传导通路为靶点研究，有望找到治疗肝纤维化的新途径。

2 参与血管重塑的主要分子

参与血管重塑的影响因素既包括分子因素，也包括机械因素。在可溶性分子因素中，生长因子是首当其冲的，如上面提过的VEGF，是调整窗口数量和直径最关键的分子[18]。VEGF对正常情况下肝脏组织愈合、肝窦正常形态的维持和肝脏再生很重要。例如，VEGF可通过影响巨噬细胞渗透和接踵而至的基质降解诱导纤维化复原[19]。有实验[20]证实，去除细胞培养基中VEGF可导致内皮细胞去窗口化，重新加入VEGF可恢复窗口化结构。同时，VEGF在肝脏再生中，可促进骨髓来源的肝窦内皮细胞填充[21]。目前的研究[22]认为，在肝损伤早期阶段，VEGF能诱导肝纤维化复原，在进展期阶段，VEGF的浓度与肝硬化和门脉高压的程度呈正相关。其机制包括减少肝内血管重塑和纤维化，减少肠系膜血管形成，减少门脉分支等。另外，研究[23]表明抑制VEGF能降低血管渗透性，有减少腹水的作用。总之，VEGF在肝损伤、肝纤维化、门脉高压及它们的修复过程中的作用仍需进一步探索。除了VEGF还有大量生长因子参与LSEC窗口化的调控，大多数是酪氨酸激酶受体的活化剂，如血管生成素、轴突导向因子、纤维母细胞生长因子等。另外，组织缺氧时会产生组织缺氧诱导因子，刺激VEGF和血管紧张素 I及其他促进肝纤维化和血管生成的细胞因子增加，且组织缺氧时，参与ECM重塑和血管生成的MMPs、整合素受体的表达也明显增加[24]。近年来，对这些细胞因子的研究不断深入，逐渐发现肝纤维化潜在的治疗靶点，如TGF-β能强烈刺激HSCs分泌胶原纤维，产生大量ECM，并能抑制ECM降解，另外，TGF-β抑制剂(吡非尼酮)已经在临床应用，治疗肺纤维化，所以有望通过TGF-β这个作用靶点找到抗肝纤维化的药物。肝纤维化时产生大量的细胞外基质，MMPs是参与细胞外基质降解最重要的酶类之一。基质金属蛋白酶组织抑制剂(tissue inhibitors of matrix metalloproteinases, TIMPs)是MMPs主要的内源性抑制因子,抑制MMPs对ECM的降解活性,参与肝纤维化的形成,能否找到有效的TIMPs抑制剂，为肝纤维化的治疗提供新方向。

同时，LSEC表型也受到生物力学(如剪切力)的调控 。剪切力是指黏性流体通过血管内腔时对内皮细胞产生的阻力。剪切力的变化非常明显，如在终末动脉，估计值为60 dyn/cm2，而在小静脉剪切力值为<10 dyn/cm2。剪切力精确的变化依赖于流率、血管直径、红细胞梯度和血管床等。作为完全的静脉系统，门脉系统与小动脉相比有较低的内皮细胞剪切力。但在微循环血管床如肝窦，则呈现出相当大的剪切力。生理性调节过程中，剪切力的变化可刺激肝窦通过某些机制调节肝窦血管直径，如HSCs收缩使肝窦血管直径减小，血管阻力增加，但也因此产生更高水平的剪切力。肝纤维化时，肝窦血管直径减小和血管紧张度增加，会增加门脉压力，促进门脉高压形成。有研究[25]表明，LSEC对剪切力增加的反应是增加一氧化氮(nitrogen oxide, NO)的产生，NO是强力的舒张血管物质之一。研究还显示，在肝脏完全灌注时，可以观察到氮氧化物的堆积。肝硬化门脉高压时，NO产生增加，可能是门脉高压高动力循环的原因之一。这可能是一个代偿机制，暴露于剪切力之下的LSEC通过增加NO的产生，来回应剪切力增加导致的肝窦血管收缩，使肝窦扩张，血管直径增加。这种生物机制的信号传导通路是通过调控LSEC中一氧化氮合成酶(endothelial nitric oxide synthase, eNOS)的活性实现，NO是eNOS的下游分子，酪氨酸激酶信号通路在此处发挥重要作用。

3 肝窦血管重塑的方式

肝窦血管重塑是肝内细胞及分子相互作用的复杂过程。静止的HSCs被激活，会导致大量的细胞外基质沉积，在肝窦周围形成基底膜。大面积的基底膜沉积和HSCs的活化及收缩会导致肝硬化时肝内血管阻力增加，增加门脉压力。肝损伤时，LSEC产生NO减少会刺激细胞分芽增殖，上调各种血管表面标志物的表达，并促进LSEC失窗口化等，最终导致肝内血管床的变异[26]。这些表现都增加了肝内血管的阻力，是早期门脉高压的特点。

当前形成新血管的过程，有两种与众不同的方式，即从已经存在的血管发芽或分裂而来。在发芽方式中，血管生长因子可促进原有血管基底膜分解，使得外周细胞、内皮细胞、平滑肌细胞彼此分离，向着刺激血管形成的因素的方向迁移。迁移后内皮细胞开始增殖，最终内皮细胞停止增殖，彼此连接，并且与外周细胞和基底膜连接，形成完整的新血管[27]。发芽血管再生涉及大量复杂的信号通路之间的相互作用，主要与内皮生长因子有关。

分裂式血管生成又称为套叠式血管生成。指相对的毛细血管壁向管腔内凹陷，逐渐靠近并相互接触融合，形成管腔中的间质柱状体；血管壁两侧的内皮细胞相互连接后被重新“整改”，形成的柱状体进一步增殖，最终分裂成两个新的毛细血管。分裂式血管形成不太依赖内皮细胞的增殖、基底膜的降解和结缔组织的浸润，因此形成新血管的速度比发芽式血管再生更快[28-29]，剪切力和血流速度的增加可能在这一过程中发挥重要作用。

两种血管形成的方式对于正常肝脏生理或病理状态都很重要，包括肝脏的胚胎发育、肝脏再生、慢性肝脏纤维化，肝结节性再生及肿瘤血管再生等。

总之，血管生成和重塑是肝纤维化发生早期的重要变化，细胞及分子机制起到尤为重要的作用，目前应用逆转肝纤维化的临床药物，如受体酪氨酸激酶抑制剂，有较好的效果，但作用非特异性，在临床应用中应谨慎。深入对肝纤维化血管形成的关键细胞及关键分子信号通路的研究，寻找特异性抑制肝窦血管重塑的细胞因子将成为研究热点。

[1]Novo E, Ccannito S, Morello E, et al. Hepatic myofibroblasts and fibrogenic progression of chronic liver diseases [J]. Histol Histopathol, 2015, 30(9): 1011-1032.

[2]Seki E, Brenner DA. Recent advancement of molecular mechanisms of liver fibrosis [J]. Hepatobiliary Pancreat Sci, 2015, 22(7): 512-518.

[3]Coulon S, Heindryckx F, Geerts A, et al. Angiogenesis in chronic liver disease and its complications [J]. Liver Int, 2011, 31(2): 146-162.

[4]Taura K, De Minicis S, Seki E, et al. Hepatic stellate cells secrete angiopoietin 1 that induces angiogenesis in liver fibrosis [J]. Gastroenterology, 2008, 135(5): 1729 -1738.

[5]Majumder S, Piguet AC, Dufour JF, et al.Study of the cellular mechanism of Sunitinib mediated inactivation of activated hepatic stellate cells and its implications in angiogenesis [J]. Eur J Pharmacol, 2013, 705(1-3): 86-95.

[6]Mejias M, Garcia-Pras E, Tiani C, et al. Beneficial effectsof sorafenib on splanchnic, intrahepatic, and portocollateralcirculations in portal hypertensive and cirrhotic rats [J]. Hepatology, 2009, 49(4): 1245-1256.

[7 ]Iwakiri Y, Grisham M, Shah V. Vascular biology and pathobiology of the liver: report of a single-topic symposium [J]. Hepatology, 2008, 47(5): 1754-1763.

[8]Ding BS, Nolan DJ, Butler JM, et al. Inductive angiocrine signals from sinusoidal endothelium are required for liver regeneration [J]. Nature, 2010, 468(7321): 310-315.

[9]Zhan S, Chan CC, Serdar B, et al. Fibronectin stimulates endothelin-1 synthesis in rat hepatic myofibroblasts via a Src/ERK-regulated signaling pathway [J]. Gastroenterology, 2009, 136(7): 2345-2355, e1-e4.

[10]Hsu SJ, Lin TY, Wang SS, et al. Endothelin receptor blockers reduce shunting and angiogenesis in cirrhotic rats [J]. Eur J Clin Invest, 2016, 46(6): 572-580.

[11]Hutchison N, Fligny C, Duffleid JS. Resident mesenchymal cells and fibrosis [J]. Biochim Biophys Acta, 2013, 1832(7): 962-971.

[12]Chen YT, Chang FC, Wu CF, et al. Platelet-derived growth factor receptor signaling activates pericyte-myofibroblast transition in obstructive and post-ischemic kidney fibrosis [J]. Kidney Int, 2011, 80(11): 1170-1181.

[13]Kong D, Zhang F, Zhang Z, et al .Clearance of activated stellate cells for hepatic fibrosis regression: molecular basis and translational potential [J]. Biomed Pharmacother, 2013, 67(3): 246-250.

[14]Lakner AM, Steurewald NM, Walling TL, et al. Inhibitory effects of microRNA 19b in hepatic stellate cell-mediated fibrogenesis [J]. Hepatology, 2012, 56(1): 300-310.

[15]Lee JS, Semela D, Iredale J, et al .Sinusoidal remodeling and angiogenesis: a new function for the liver-specific pericyte? [J]. Hepatology, 2007, 45(3): 817-825.

[16]Lai L, Chen Y, Tian X, et al. Artesunate alleviates hepatic fibrosis induced by multiple pathogenic factors and inflammation through the inhibition of LPS/TLR4/NF-κB signaling pathway in rats [J]. Eur J Pharmacol, 2015, 765: 234-241.

[17]Mak KM, Png CY, Lee DJ. Type V Collagen in Health, Disease, and Fibrosis [J]. Anat Rec (Hoboken), 2016, 299(5): 613-629.

[18]May D, Djonov V, Zamir G, et al. A transgenic model for conditional induction and rescue of portal hypertension reveals a role of VEGF-mediated regulation of sinusoidal fenestrations [J]. PLoS One, 2011, 6(7): e21478.

[19]Yang L, Kwon J, Popov Y, et al. Vascular endothelial growth factor promotes fibrosis resolution and repair in mice [J]. Gastroenterology, 2014, 146(5): 1339-1350.

[20]Zhang W, Wray LS, Rnjak-Kovacina J, et al. Vascularization of hollow channel-modified porous silk scaffolds with endothelial cells for tissue regeneration [J]. Biomaterials, 2015, 56: 68-77.

[21]Wang L, Wang X, Wang L, et al. Hepatic vascular endothelial growth factor regulates recruitment of rat liver sinusoidal endothelial cell progenitor cells [J]. Gastroenterology, 2012,143(6): 1555-1563,e2.

[22]Fallowfield J. Macrophage-derived vascular endothelial growth factor and angiogenesis within the hepatic scar-new pathways unmasked in the resolution of fibrosis [J]. Hepatology, 2015, 61(6): 1790-1792.

[23]Becker G, Blum HE. VEGF Trap for the treatment of malignant ascites [J]. Lancet Oncol, 2012, 13(2): 115-116.

[24]Zhao SS, Shao RG, He HW. Potential targets for anti-liver fibrosis [J]. Acta Pharm Sin, 2014, 49(10): 1365-1371.

[25]Shafiei MS, Lui S, Rockey DC. Integrin-linked kinase regulates endothelial cell nitric oxide synthase expression in hepatic sinusoidal endothelial cells [J].Liver Int， 2015, 35(4): 1213-1221.

[26]De Spiegelaere W, Cornillie P, Van Den Broeck W, et al. Angiopoietins differentially influence in vitro angiogenesis by endothelial cells of different origin [J]. Clin Hemorheol Microcirc, 2011, 48(1): 15-27.

[27]Flex A, Biscetti F, Iachininoto MG, et al. Human cord blood endothelial progenitors promote post-ischemic angiogenesis in immunocompetent mouse model [J]. Thromb Res, 2016, 141: 106-111.

[28]Ribatty D, Crivellato E. “Sprouting angiogenesis”, a reappraisal [J]. Dev Biol, 2012, 372(2): 157-165.

[29]De Spiegelaere W, Casteleyn C, Van Den Broeck W, et al. Intussusceptive angiogenesis: a biologically relevant form of angiogenesis [J]. J Vasc Res, 2012, 49(5): 390-404.

(责任编辑：王全楚)

Progress of sinusoidal vascular remodeling in hepatic fibrosis

LI Hao, CHEN Jing

Department of Gastroenterology, the Second Affiliated Hospital of Harbin Medical University, Harbin 150000, China

Hepatic fibrosis and portal hypertension are the final stages of a variety of chronic liver diseases, hepatic fibrosis is a compensatory pathological change in the repairing process of all kinds of chronic liver injury tissue, which is also a necessary stage of cirrhosis.Hepatic sinusoid is a specific liver microvascular system, and sinusoidal vascular have remodeled before liver fibrosis happens, and it further develops pathological blood vessels. And hepatic sinusoid vascular remodeling is one of the important mechanisms for the formation of liver fibrosis and portal hypertension.The article emphatically introduces many significant cells and molecules involved in hepatic sinusoid vascular remodeling and the ways of hepatic sinusoid vascular remodeling. There are mainly two ways of vascular remodeling, germination mode and split mode. It is believed that if we further study the key cells and molecules signaling pathways in the process of sinusoidal vascular remodeling and find more effective therapeutic targets, it is expected to find clinical drugs that can inhibit hepatic sinusoidal vascular remodeling and reverse the early stage of hepatic fibrosis.

Hepatic fibrosis; Pathogenesis; Sinusoidal vascular remodeling

李昊，硕士研究生，研究方向：肝纤维化发病机制。E-mail:719906572@qq.com

陈晶，副主任医师，硕士研究生导师，研究方向：肝纤维化发病机制。E-mail:chenjing7@medmail.com.cn

10.3969/j.issn.1006-5709.2017.03.027

R575

A 文章编号：1006-5709(2017)03-0344-04

2016-05-31