结核性脑膜炎实验室诊断方法研究进展

李淑敏，李垚，孙巧凤，王梓涵，王苏平

结核性脑膜炎实验室诊断方法研究进展

李淑敏，李垚，孙巧凤，王梓涵，王苏平

1 细菌学方法

CSF涂片抗酸染色镜检、细菌培养找到结核杆菌是诊断TBM最经典的实验室方法。目前诊断TBM最常用的便捷方法是CSF涂片找抗酸杆菌，但传统抗酸染色法阳性率极低，据报道[2]国内外传统抗酸染色阳性率在10%左右，不能满足临床需要。邹月丽等[3]研究的改良抗酸染色法，通过改变传统的试管离心法的离心条件，采用细胞收集法，并且与TritonX-100破膜技术相结合，将检出率提高至88.57%。若在病程中多次腰椎穿刺行改良抗酸染色法，可提高至94.29%，并且能检出胞内抗酸杆菌。传统抗酸染色法往往在患者接受抗结核治疗后1周就不能检出抗酸杆菌，此种改良方法将时间延长至27 d左右，最长的在患者接受治疗6.5个月后仍能检出，明显延长了抗酸杆菌的检出时间。

2 免疫学检查

2.1 结核分枝杆菌(MTB)抗体指标 MTB有很复杂的抗原成分，感染人体后会产生一系列的抗体，因此测定CSF或者血液中的抗体成分对TBM有一定的辅助诊断价值。较为常见的抗体指标如下。

2.1.1 脂肪阿拉伯酸甘露聚糖(LAM)抗体(LAM-IgG) 薛承岩等[4]用检测CSF LAM-IgG来诊断TBM，敏感性和特异性分别为51%和100%。郑智远等[5]采用ELISA方法定性检测血清和CSF中的LAM-IgG，结果显示单独检测血清和CSF的LAM-IgG，敏感性分别为45.45%、48.05%，特异性分别为96.67%、100%，二者之间差异无统计学意义，均可单独用于诊断TBM；同时检测血清和CSF中的LAM-IgG，敏感性和特异性分别为55.84%、96.67%，敏感性较单独检测血清或者CSF要高。因此定性检测LAM-IgG是诊断TBM的一种辅助手段，无论是血清还是CSF LAM-IgG阳性均有一定的价值，且同时检测血清和CSF可以提高TBM的诊断率。

2.1.2 MTB特异性蛋白(TBSA)抗体 TBSA是一种特异性较高的MTB分泌性酸性磷酸酯酶。王学东等[6]同时进行血清、CSF TBSA抗体检测，TBM组阳性率为37.7%，非TBM组阴性率为73.6%。王晓艳等[7]检测了血清和胸水中的TBSA抗体水平，结果显示诊断肺结核的敏感性及特异性分别为70.5%、73.5%，但诊断TBM的敏感性仅为41.9%。所以TBSA抗体的检测对于活动性肺结核是一种快速简便有较高敏感性和特异性的辅助诊断方法，对TBM的诊断价值不高，但在排除TBM的诊断中具有一定的价值。

2.2 MTB抗原指标 机体感染MTB后，MTB的各种抗原成分作用于免疫系统出现一系列的反应，所以抗原成分是MTB感染后最先能够检测到证实其存在的直接证据，且不受机体免疫能力的影响。近年来较为常见的指标如下。

2.2.1 早期分泌的特异性靶抗原6(ESAT-6) MTB感染ESAT-6仅存在于致病性分枝杆菌中，是致病性MTB产生的特异性抗原成分，避免了不致病MTB及其他分枝杆菌的干扰；并且在卡介苗的传代过程中删除了EAST-6基因，所以可排除卡介苗接种的干扰；除此之外还避免了无胞壁的L型菌不易被检出的不足。朱雅娟等[8]于病程中的不同时间收集CSF，分别用ELISA法定量检测ESAT-6水平，观察病程中ESAT-6的动态变化，结果证实了早期检测ESAT-6对诊断TBM的意义，而且提示对于未能及时就医或是经过治疗干预的患者ESAT-6仍有一定的补充诊断意义。

2.2.2 培养滤液蛋白10(CFP-10) CFP-10是MTB在早中期分泌释放于菌体外的一组低分子量蛋白，仅存在于致病性分枝杆菌，在卡介苗及其他分枝杆菌中缺失[9]，故具有诊断性抗原优势。张昆南等[10]采用CSF抗原负压浓缩及酶联免疫斑点法(ELISPOT)检测CFP-10，敏感性为93.1%，特异性为92.5%，该法显著提高了TBM的检出率。以后此研究组[11]又采用反透析方式浓缩CSF、应用ELISA检测CFP-10，与CSF原液相比较，敏感性显著提高，为78.26%，检测时间短，操作便捷，特异性高。

目前也有研究[12]提出以CFP-10和ESAT-6的融合蛋白作为检测指标，综合了单一抗原的优势，具有更强大的活化能力，比单一抗原更为敏感，且不降低特异性。马春静等[13]采用时间分辨荧光免疫法定量测定CSF中ESAT6-CFP10抗原的含量，结果显示该法灵敏度非常高，且特异性较好，为92.6%，明显比常规的ELISA法和MTB涂片或培养法高，而且该法对检测条件的要求不高，因此该法可作为一项新的检查手段用于临床MTB感染的早期诊断。

2.2.3 LAM LAM是MTB细胞壁的重要组成部分，具有菌属特异性和高度的免疫原性，为MTB的重要抗原。以往主要用LAM-IgG抗体诊断结核病，通过体液中LAM-IgG反映MTB的感染情况。但抗体的产生需要时间，且易受机体免疫状态的影响，不能鉴别既往或新近感染，故应用价值受到局限。田宋新等[14]采用ELISA法检测CSF及血清中的LAM含量，结果显示，TBM组CSF及血清中LAM含量均高于非TBM组和对照组(均P<0.05)，表明LAM是诊断TBM的一个有用参数。且该研究中对ESAT-6和LAM表达水平进行了Pearson相关分析，结果显示有较高的相关性，表明这两项指标对诊断TBM具有较好的临床应用价值，且联合检测更有利于TBM 的诊断，LAM抗原的检测，弥补了检测LAM-IgG抗体诊断TBM的不足。

2.3 细胞因子指标 机体感染MTB后以细胞免疫为主，细胞因子在TBM的免疫反应中起到了重要的作用。CSF中的大量细胞因子直接反映了TBM的病理变化，是直接的诊断指标。王丽豪等[15]采用蛋白芯片与ELISA相结合的方法筛选出单核细胞趋化蛋白-2(MCP-2)、γ-干扰素(INF-γ)、IL-8与TBM密切相关，有可能作为具有TBM诊断意义的细胞因子。

2.3.1 INF-γ INF-γ是T淋巴细胞在一定的刺激原作用下产生的一种细胞因子,机体在受到MTB感染后，INF-γ通过刺激巨噬细胞增加一氧化氮的生成而介导巨噬细胞杀灭MTB[16]，可反映机体受MTB感染后的免疫应答状态。以INF-γ水平为指标诊断TBM较常见的方法有MTB INF-γ体外释放试验(TB-IGRA)、直接检测CSF中INF-γ水平。

2.3.1.1 TB-IGRA 目前INF-γ释放分析技术常见的有ELISA及ELISPOT法。钱福初等[17]用MTB特有抗原(ESAT-6、CEP-10)在体外作用于外周血，然后用ELISA检测INF-γ水平，对TBM的诊断的敏感性达87.5%，准确率89.7%。曾剑锋等[18]用抗原ESAT-6作用于外周血淋巴细胞，然后用ELISPOT检测INF-γ水平，TBM组及肺结核组阳性率明显高于健康对照组，证明该法能特异性区分结核病患者和健康人，但TBM组和肺结核组相比较，其INF-γ应答水平和阳性率都较低，考虑与该研究中各组患者的免疫反应水平受到病情严重程度及糖皮质激素应用的影响有关。潘燕玉等[19]用抗原(ESAT-6、CEP-10)在体外分别作用于CSF、外周血淋巴细胞，再用ELISPOT检测INF-γ水平，结果显示，CSF ELISPOT检测的敏感性和特异性分别为92.3%和94.1%，血ELISPOT检测的敏感性为100%，特异性仅为42.2%，这与非TBM组有部分合并脑外结核有关。

2.3.1.2 直接检测CSF中INF-γ水平 黄锡坤等[20]用ELISA法分别检测各组的CSF及血清中的INF-γ水平，CSF中INF-γ水平诊断TBM的灵敏度、特异度分别达92.0%、95.3%，且CSF与血清INF-γ水平无相关性。张燕等[21]也是通过ELISA法检测各组的CSF及血清中的INF-γ水平，结果显示CSF中INF-γ水平诊断TBM的灵敏度、特异度分别为84.2%、96.5%。分析原因考虑可能为TBM的局部细胞免疫功能增强，在MTB抗原的刺激下，CSF产生高水平INF-γ，而外周血INF-γ水平偏低。综上，外周血和CSF中INF-γ水平均可作为诊断TBM的辅助方法，且CSF更具优势。

2.3.2 MCP-2 MCP-2通过与趋化因子受体1、受体2B及受体5相互作用，趋化迁移粒细胞及单核细胞，因此与TBM密切相关。王丽豪等[15]的研究中，ELISA检测结果显示TBM组MCP-2[(18.5±6.3)pg/ml]与病毒性脑膜炎组[(1.5±0.5)pg/ml]、非感染组[(0.4±0.1)pg/ml]的差异均具有统计学意义，故有可能用于TBM的快速诊断。

2.3.3 IL-8 IL-8是单核细胞在MTB刺激下产生的一种细胞炎性因子，促进炎症细胞的趋化及诱导细胞增值，参与细胞免疫及迟发型超敏型炎症的发生，致局部的炎症反应，能杀灭MTB，也能造成血-脑屏障的破坏和脑组织局部免疫损伤[22]。王丽豪等[15]研究结果表明，TBM组IL-8较病毒性脑膜炎组、非感染组显著升高，IL-8与TBM密切相关。马江涛等[16]研究结果表明TBM急性期IL-8水平显著高于其恢复期和对照组水平(均P<0.01)，病情控制好转后其表达显著下降，与对照组差异无统计学意义。所以IL-8水平的测定对TBM具有一定的诊断价值，且其表达水平动态变化有助于疗效观察和判断预后。

2.3.4 干扰素诱导蛋白10(IP-10) IP-10属于趋化因子中CXC亚家族，又称为CXCL10。可趋化单核细胞、T细胞和NK细胞等多种特异表达CXCR3受体的炎性细胞进入炎症部位，进而介导Th1型炎症疾病[23]。杨红等[24]通过ELISA方法检测CSF中IP-10水平，并与IFN-γ检测结果相比较，结果显示这二者对TBM的诊断效能相近，诊断临界值分别为605.52 pg/ml和178.04 pg/ml，敏感性分别为86.7%和90%，特异性分别为96.7%和93.3%，且对于免疫反应较弱的患者，IP-10可能有更高的诊断价值。

3 生化指标

3.1 腺苷脱氨酶(ADA) ADA是一种核酸代谢酶，与机体细胞免疫活性密切相关，ADA表达上升是T淋巴细胞分化、增值的病理改变。机体感染MTB后以细胞免疫为主，故检测ADA水平可在一定程度上反映MTB感染情况。温昌明等[25]采用酶法对CSF中的ADA进行检测，结果显示TBM组较化脓性脑膜炎组、病毒性脑膜炎组明显升高；钟晶等[26]采用酶标法检测CSF中ADA水平，结果显示TBM组[(8.94±8.52)U/L]较化脓性脑膜炎组[(5.68±3.1)U/L]、病毒性脑膜炎组[(2.94±1.27)U/L]和非感染组[(0.58±0.16)U/L]差异均有统计学意义；Sun等[27]的研究结果提示ADA定量诊断TBM的最佳界值是9.5 U/L，且ADA水平随着有效的抗结核治疗而逐渐下降。

3.2 CSF与血浆生化指标比值 发生疾病时，血-脑屏障受到损害，CSF的成分和性质在代谢、渗透压等多种因素的影响下发生改变，但除此之外机体的其他疾病状态，如糖尿病等也会影响CSF中各物质的含量，所以排除血浆因素对CSF的影响会使得各指标对TBM的诊断更加准确。汤海燕等[28]分别检测各组CSF、血浆中的糖、蛋白质、ADA、氯化物含量，然后计算出各指标CSF/血浆比值，结果显示TBM组蛋白比值、ADA比值高于化脓性脑膜炎组，氯化物比值低于化脓性脑膜炎组，差异均有统计学意义(均P<0.05)。且通过绘制ROC曲线验证了CSF/血浆ADA比值和氯化物比值对诊断TBM有较大的意义，尤其当ADA比值≥1.19且氯化物比值≤0.93时诊断TBM的敏感度和特异度均较高。这种方法简单、易行，费用低，耗时短，对于TBM的早期诊断具有较高价值。

3.3 DLL1配体 DLL1配体由723个氨基酸组成的一种L型跨膜蛋白，是一种Notch配体[29]。Notch家族是一组跨膜受体，作用于多个器官、细胞的发育，并决定细胞的分化方向[30]。Notch 信号通路的异常可能与多种CNS疾病的发展有关。Notch 1信号通过调节脂肪酸的活化而影响脂肪细胞的形成，并在脂肪代谢中发挥重要作用[31]。结核病是一种慢性消耗性疾病，引起脂肪酸代谢紊乱以及脂肪细胞过度活化，加速DLL1的脱落，作为Notch配体帮助Notch信号促进脂肪细胞的分化。Peng等[32]通过ELISA方法定量检测CSF、血清中的DLL1含量，结果发现TBM组CSF、血清中DLL1水平明显高于其他组，且CSF中的DLL1 水平与血清中的含量有关，但与细胞浓度、蛋白、糖、氯化物及CSF压力无关。所以CSF和血清中DLL1含量的检测有可能成为一种TBM的早期诊断手段。

3.4 宿主热休克蛋白 热休克蛋白是普遍存在的分子伴侣，结合和帮助折叠新生或者变性的多肽，也被认为是对抗病原体的免疫反应的主要免疫原[33-34]。宿主热休克蛋白除了有分子伴侣功能之外，被认为参与抗原递呈内源性通路，导致CD8+T细胞的激活[35],这可能是其在结核病中增加的原因。Shekhawat等[36]采用间接性ELISA法检测CSF中的热休克蛋白，其中热休克蛋白70、热休克蛋白90的敏感性分别为89%、88%，特异性分别为82%、89%。虽然热休克蛋白25、热休克蛋白60的敏感性较高，分别为94%、96%，但均缺乏特异性。所以热休克蛋白70、热休克蛋白90在TBM的早期诊断中表现出了更高的价值，但试验[36]也发现这些热休克蛋白的联合应用能有效区分TBM患者与其他对照疾病患者。综上，宿主热休克蛋白对于TBM的诊断有较好的应用前景，但也仍需要扩大样本进一步研究。

4 分子生物学方法

4.1 PCR 在目前的研究中，一些MTB特殊的DNA序列纷纷被用作引物，如编码麦芽糖结核蛋白(MBP)64的基因MBP64、热休克蛋白的基因、IS6110基因等。大部分诊断TBM的研究中所用的PCR以单一的靶基因扩增，但由于这些基因在某些MTB个体中可能是没有的，所以可能导致假阴性的结果。新的分子生物学方法[37]，以几个基因为靶基因行多重PCR扩增可被用于克服这个问题，如采用采用蛋白b、MBP64、IS6110设计的多重PCR扩增的灵敏度、特异度在确诊的TBM患者中分别显示为94.4%、100%。目前传统PCR的各种改良方法被尝试用于诊断TBM，如巢式PCR、实时定量PCR以及结合这二者的嵌套实时定量PCR技术，虽然目前因为技术的不完善、检测方法的不规范，不同实验室的结果有所差异，但大部分结果显示出了较高的敏感性和特异性。目前这些技术仍较少用于临床诊断TBM，因为这些方法实际操作中步骤繁琐、耗时、耗力且对实验设施要求较高，故对于临床常规实验实用性较低[38]。

4.2 GeneXpertMTB/RIF系统 GeneXpertMTB/RIF系统为全自动核酸扩增技术，以半巢式荧光定量PCR为基础，以MTB对利福平耐药相关基因ropB为靶基因[39]，作为一种新的分子生物学诊断方法，经过大量试验后在2010年被世界卫生组织认可用于肺结核的诊断，虽然以CSF为标本用于TBM的诊断价值目前并未得到确定，但已有大量的报道指出该系统在TBM的早期诊断及治疗中的重要价值。Nguyen-Thi等[40]试验发现该技术敏感度为59.3%，特异度为99.5%，其敏感度明显低于抗酸染色涂片法、分枝杆菌生长指示管培养法。虽然该技术的敏感度并不高，但却有两个主要的优点：(1)以一个封闭的检验系统为基础；该法操作简便，对工作人员的技术要求较低，可应用于实验室外的环境，生物危害及交叉污染风险小[41]；(2)同时检测出MTB以及利福平耐药性，快速得出结果。对结核病的早期诊断、及时治疗具有重要价值，并且对于结核病流行地区具有一定的可行性，因此受到推荐。

综上所述，本文所列TBM早期实验室诊断方法中，目前较常用的便捷方法仍属CSF涂片法，采用改良抗酸染色法能够明显提高阳性率及延长抗酸杆菌的检出时间，但是由于不能确定为结核抗酸杆菌以及不能区分致病和潜伏感染状态[3]，仍有一定的局限。免疫学指标中，抗原指标相对优于抗体指标，以CFP-10和ESAT-6的融合蛋白作为检测指标，采用时间分辨荧光免疫法定量测定CSF中ESAT6-CFP10抗原的含量，表现出非常高的灵敏度，以及较好的特异性，且该法对检测条件的要求不高，故可用于临床MTB感染的早期诊断[13]。对于生化指标，测定CSF与血浆ADA比值和氯化物比值有着较高的敏感性和特异性，这种方法简单、易行，费用低，耗时短[28,42]，对于TBM的早期诊断值得推荐。分子生物学方法中，GeneXpertMTB/RIF系统的敏感度虽然不高，但由于其操作简便，可应用于实验室外的环境，且能同时检测出MTB以及利福平耐药性，快速得出结果，有利于结核病的早期诊断与及时治疗，因此对于结核病流行地区有一定的可行性[40]。此外，部分指标仍具有一些其他的应用价值，如IL-8、ADA有望应用于病情监测和疗效观察[27]；ESAT-6对于未能及时就医或是经过治疗干预的患者有一定的补充诊断意义等[8]。但是目前仍尚未有一种便捷、经济、有效的TBM早期实验室诊断方法得到明确的指南推荐，以上的大部分方法还需要扩大样本进一步验证研究。除此之外，MTB的生物学特性、基因也需要继续探索，以寻找更特异敏感的免疫学指标来提高TBM的早期诊断率。

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R529.3

A

1004-1648(2017)02-0151-04

116033大连医科大学附属大连市中心医院神经内科

结核性脑膜炎(TBM) 是结核杆菌引起的脑膜非化脓性炎性疾病。在结核杆菌感染疾病中，TBM表现形式最严重，死亡率、致残率均较高，其预后与及时有效的治疗密切相关。但由于TBM早期临床表现缺乏特异性，易被误诊从而延误治疗，所以建立敏感度高、特异性强并适合临床推广的实验室早期诊断方法是有效治疗、改善预后的关键所在[1]。本文将TBM实验室诊断方法的研究进展作一综述如下。

2016-05-03

2016-05-16)