超高效液相色谱法测定水产品保鲜剂中4-己基间苯二酚的含量

高学慧，郝云彬，张小军，梅光明，陈 思，严忠雍，李佩佩，常家琪,4，韩程程,4

（1.浙江海洋大学水产学院，浙江舟山 316022；2.浙江海洋大学海洋与渔业研究所，浙江省海洋水产研究所，浙江舟山 316021；3.江南大学食品学院，江苏无锡 214122；4.浙江海洋大学食品与医药学院，浙江舟山 316022）

近年来，食品安全问题越来越多，由于水产品储藏期较短，水产品保鲜剂的广泛应用备受人们的关注。4-己基间苯二酚（4-hexylresorcinol，4-HR）为白色、黄白色针状结晶，分子式为C12H18O2，分子量为194.27，结构式如图1所示，近年来作为一种新型的抗氧化剂，广泛应用于各种食品的保鲜过程中。1991年MCEVILY[1]首先提出4-HR在防止虾类黑斑形成以及氧化黑变中应用，作为虾中酚氧化酶的有效抑制剂，杨峰等[2]研究了4-HR能够有效的抑制南极磷虾脂肪的氧化，对其品质变化影响显著。随后研究发现，4-HR可对苹果、杏鲍菇、鸡腿菇[3]等原料产生同样的抑制褐变的效果。周会玲等[4]采用不同浓度4-HR处理红富士苹果，结果表明4-HR能有效的抑制鲜切苹果的褐变，提高贮藏品质。王毓[5]采用超高效液相色谱-串联质谱法测定鲜切杏鲍菇中4-HR的含量，表明4-HR对果蔬具有良好的抗褐变效果，是亚硫酸盐、抗坏血酸等良好的替代品，也可为杏鲍菇保鲜贮藏以及食品安全质量监督提供技术理论。根据我国《食品添加剂使用卫生标准》（GB2760-2014）规定：鲜水产（仅限虾类）最大使用量可按生产需要适量使用，最大残留量≤1 mg/kg。由于水产品水分含量高，其储藏期较短，易引起腐败、褐变等现象，使用食品添加剂可以有效的改善水产品的外观及品质，4-HR作为水产品保鲜剂的成分之一，在水产品保鲜过程中得到了广泛的使用。

目前，国内外检测4-HR的方法最主要有气相色谱法、高效液相色谱-荧光法[6-8]、超高效液相色谱-串联质谱法[9]和气相色谱-质谱法[10]。高效液相色谱-荧光法作为一种灵敏度高、快速准确定性定量检测技术，已广泛应用到对虾蟹类等水产品中4-HR残留量的测定。但是对于保鲜剂中4-HR的含量测定，国内鲜有报道。本研究采用超高效液相色谱法对保鲜剂中4-HR含量进行分析，用于检测保鲜剂产品的质量以及保鲜剂剂在添加过程中的使用量，同时，可判断市售标识含有4-HR的水产品保鲜剂的真伪，对4-HR在虾类保鲜剂研究领域应用提供依据。

图1 4-己基间苯二酚的结构Fig.1 Structure of 4-hexylresorcinol

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

ACQUITYTM超高效液相色谱仪（美国waters公司）包括荧光检测器（美国waters公司）；MS2漩涡混合器（德国IKA公司）；Centrifuge 5810高速离心机（德国Eppendorf公司）；R-201型旋转蒸发仪（上海科兴仪器有限公司）；超声波清洗器（上海科导超声仪器有限公司）；AL204型电子天平（感量为0.1 mg）；SL-502N型台式天平（感量为0.01 g）

实验用水为Milli-Q制备高纯水；乙酸乙酯均为色谱纯（德国Merk公司）；无水乙酸铵（色谱纯，美国Merk公司）；乙腈等其他试剂均为国产分析纯；4-己基间苯二酚标准品（C12H18O2，纯度为99%，中国Alfa Aesar公司）

4-HR标准储备液：称取5.0 mg（精确至0.1 mg）的标准品于50 mL容量瓶中，用甲醇溶液溶解并定容至刻度，配制成浓度为100 mg/kg标准储备液，贮藏于-18℃冰箱中密封保存，溶液有效期为1个月。

1.2 色谱条件

色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18 柱（2.1 nm×150 mm，1.7 μm）；流动相：乙腈-水（7/3，V/V）；柱温：35℃；样品室温度：10 ℃；激发波长：280 nm；发射波长 310 nm；进样量：5 μL。

1.3 样品前处理

称取0.1 g粉末（精确到0.01 g）样品置于50 mL离心管中，加入25 mL乙腈溶解，盖塞，旋涡混匀1 min，超声提取10 min，6 000 r/min离心5 min，取0.5 mL过滤液于50 mL容量瓶中，用流动相定容至刻度。取1 mL经0.22 μm有机相微孔滤膜过滤，上机测定。

2 结果与讨论

2.1 提取溶剂的确定

4-己基间苯二酚是一种弱酸性物质，微溶于水，易溶于极性有机溶剂。由于乙酸乙酯、环己烷、二氯甲烷等为正相溶剂，对仪器有一定的损害，且易挥发，在旋蒸的过程中可能有一定的损失，其提取效率较低。本实验选用乙醇、甲醇、乙腈三种有机试剂作为提取剂，对于甲醇和乙醇来说，提取的杂质峰较多，对于4-HR峰的测定有干扰，影响结果的准确性。而乙腈提取效率高，杂质较少，未见干扰峰，能满足提取分析要求，结果见表1。综上所述，本方法选择乙腈作为提取溶剂。

表1 不同溶剂提取效果比较Tab.1 Comparison of extraction effect of different solvents

2.2 色谱条件优化

比较分析了乙腈-水（70：30，a）、乙腈-水（60：40，b）、甲醇-水（70：30，c）和甲醇-水（60：40，d）作为流动相时色谱图基线、峰型、4-HR与杂质干扰峰的分离效果，结果表明：当乙酸铵溶液为流动相时，杂质干扰峰较多，且不能和样品中杂质峰分离，因此选用水最为流动相。有机溶剂为乙腈时，色谱图基线更平稳，杂质干扰峰较少，出峰时间适中，分离效果最佳，因此选用乙腈作为有机相。在反相液相色谱中，有机溶剂比例越大，目标物保留时间越短；但为让目标峰与溶剂峰以及其它杂峰分离，实验最终选用乙腈-水（70：30）作为流动相。不同溶液作为流动相的洗脱色谱图如图2所示。

由于4-HR对荧光具有特异性，采用荧光检测器对其进行分析，荧光检测器[11]灵敏度较高，且抗干扰能力比较强。数据率为5点/s时，4-HR峰均匀对称，单峰采集点数充分，且基线也无密集杂乱等现象。段小娟等[12]采用高效液相色谱荧光检测法测定虾中的4-HR，在5.0 min左右时出峰，本方法目标物在2.0 min左右即出峰，可明显缩短分析时间，具有检测时间短的优点。

图 2 以乙腈-水（a）、乙腈-水（b）、甲醇-水（c）、甲醇-水（d）为流动相洗脱色谱图Fig.2 Chromatogram of 4-HR using acetonitrilewater （a）,acetonitrile-water （b）,methanol-water （c）and methanol-water（d）as mobile phase

2.3 标准工作曲线和检出限

准确量取适量标准储备液，用流动相稀释成浓度分别为0.10 μg/mL、0.50 μg/mL、2.00 μg/mL、5.00 μg/mL、10.00 μg/mL以及20.00 μg/mL标准工作溶液，分别进样5 μL，以峰面积为横坐标，浓度为纵坐标，绘制标准工作曲线（图3）。线性方程为，R=0.999，表明4-HR的浓度与相应峰面积在0.10～20.00 μg/mL范围内呈现良好的线性关系。保鲜剂溶液中最低检出浓度为5.0 μg/kg，保鲜剂粉剂的检出限为2.0 mg/kg。

图3 4-HR标准工作曲线的线性关系Fig.3 Linear relationship of 4-HR standard working curves

2.4 方法的准确性和精密度

按照前处理方法，对空白保鲜剂样品中添加不同浓度的4-HR标准溶液进行加标回收实验，添加浓度分别为0.50 μg/mL、2.00 μg/mL和10 μg/mL，每个浓度水平重复6次，结果见表2。研究发现方法回收率为83.75%～100.70%，相对标准偏差小于5.76%，该方法回收率和精密度可以满足检测的要求。

表2 加标样品的平均回收率和相对标准偏差Tab.2 The average recoveries and RSD of the spiked samples

2.5 实际样品分析

本研究利用建立的的4-HR检测方法对市售虾类保鲜剂样品进行了实际检测。从市场购买了5家公司的保鲜剂，将固体粉末分别用乙腈浸提一定时间后，超声后经高速离心取上清溶液待测。检测结果发现本次检测的5个样本中，仅有1个样本呈现阳性，阳性样品的典型色谱图（图4）。色谱图清晰准确，与标准品色谱图相一致（图5），可满足检测要求。另外4种不同品牌的保鲜剂样品均未检出4-HR成分，其空白样品色谱图如图6所示。对空白样品进行分析发现在目标峰处没有响应值，且基质噪音响应值较小，表明基质在目标质谱质量数附近不会造成干扰。实际样品检测表明本方法快速准确，灵敏度高。对于市售标识含有4-HR的水产品保鲜剂中，是否达到标识要求的含量，需要引起有关部门的高度重视。

图4 阳性样品中色谱图（0.2 mg/kg）Fig.4 Chromatogram of positive samples（0.2 mg/kg）

图5 0.5 μg/mL 4-HR标准溶液色谱图Fig.5 Chromatogram of 4-HR standard solution（0.5 μg/mL）

图6 空白样品色谱图Fig.6 Chromatogram of blank sample

3 总结

如今食品添加剂的种类越来越多，4-HR作为一种新型的抗氧化剂，在水产品加工、贮藏和保鲜的过程中广泛使用，对其进行准确的定量有着重要的应用价值。本研究采用超高效液相色谱-荧光检测法建立了水产品保鲜剂中4-HR的含量测定方法，方法稳定性好，准确度和精密度均符合检测的要求，为市售标识含4-HR的水产品保鲜剂的真伪提供了一种准确、快速的检测方法。

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