饲料中添加硒化壳聚糖对大鳞副泥鳅抗氧化能力的影响

黎 醉，高 阳，赵 波，牟 毅，储张杰

（浙江海洋大学水产学院，浙江舟山 316022）

大鳞副泥鳅Paramisgurnus dabryanus属鲤形目，鳅科，副泥鳅属，具有营养价值高、生长速度快，环境适应能力强和市场价值高等特点，已成为最具潜力的养殖品种之一，养殖规模也以极快的速度发展。在我国除青藏高原外，湖泊、水库、稻田、沟渠均有养殖。目前，我国稻田养殖每亩可产泥鳅340～450 kg[1]。

硒是动物正常生长所必需的营养元素，在动物抗氧化和细胞代谢方面具有重要作用[2]。在动物养殖过程中硒的添加方式主要有两种，一种是在日粮中添加亚硒酸钠[3]，另一种是以酵母硒（Se-Cys）或者硒代蛋氨酸（SelMet）的有机形式添加[4]。无机硒在使用过程中利用率低、毒性大并且残余的无机硒会对环境造成污染[5]。而有机硒，如富硒酵母，作为日粮添加剂具有效率高，污染小等优点，但硒含量低，制备工艺复杂，且费用高[6]。壳聚糖是一种来源于甲壳的阳离子多糖，是甲壳纲动物和昆虫的外骨骼中广泛存在的N-乙酰葡萄糖胺天然聚合物[7-8]。壳聚糖能够促进水产动物生长，提高抗疾病能力[9]。许多研究表明，壳聚糖具有多种生物功能，例如抗肿瘤活性、免疫增强活性、降血脂活性和凝血因子活性[10-11]。壳聚糖结构中的N和O能结合金属离子和活性物质。因此通过化学合成，可将壳聚糖与无机硒—亚硒酸钠合成硒化壳聚糖。

硒化壳聚糖的潜在免疫刺激作用，已在家禽及贝类的许多研究中被证实[12]。而在水产动物应用中也有发现，硒化壳聚糖可提高栉孔扇贝Chlamys farreri的免疫能力[3,13]。但至今为止，有关硒化壳聚糖对鱼类抗氧化能力的影响研究还很少。鱼类抗氧化能力是鱼类免疫功能的一个重要方面，主要与鱼体内谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）、过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）等活性以及丙二醛（MDA）含量密切相关。鉴于此，本文主要研究硒化壳聚糖作为饲料添加剂对泥鳅抗氧化能力的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物

实验用鱼来自舟山市台岛鳅业有限公司，起始平均体质量为4.9±0.2 g。

1.1.2 饲料组成

本次实验所用硒化壳聚糖为浙江海洋大学药学实验室化学合成。对照组的泥鳅饲喂基础饲料，实验组饲料在基础饲料中添加了0.3%、0.6%、0.9%和1.2%硒化壳聚糖，两组饲料均为浮性颗粒饲料。基础饲料营养水平按照我们之前实验中的饲料配方，即磷酸二氢钙1.8%、维生素预混料0.12%、小麦麸皮7%、菜籽饼4%、花生油2%、鱼粉22%、豆粕35%、玉米17%、微量元素预混合饲料0.08%、羧甲基维生素纳1%、麦饭10%。

1.2 实验方法

实验开始前，挑选1 000尾大小规格基本一致的泥鳅暂养于实验室300 L的水桶中。实验开始时，选取450尾体质健壮、规格相近的泥鳅随机放养到15个容积为20 L的水族箱中，分为5组，每组3个重复，每个重复组中30尾泥鳅。注入的水为充氧曝气自来水，使用4个12 W四孔充氧机24 h不间断充氧。整个实验过程水温控制在24±1℃，氨氮和亚硝酸盐浓度分别控制在0.06 mg/L和0.02 mg/L以下，pH 7.1，溶氧保持在5.0～6.0 mg/L，每天换水1/3。每天投喂2次（早上8:00和下午6:00），每次投喂量占泥鳅体重的5%～7%，每次投喂1 h后清除残饵和粪便，实验时间为60 d。

饲养结束时，停喂24 h后取样，每个重复组随机取10尾鱼用MS-222（Sigma-Aldrich）麻醉，鱼体表面用70%乙醇进行消毒，然后用手术刀将泥鳅的肝脏快速剖出称重，放于冰块上切碎，在-80°C冰箱保存。分析时，在低温条件下，用10倍的冰冻去离子水制成匀浆，再用离心机在3 000 r/min转速下离心10 min，获得上清液，测定CAT、GPX、SOD、MDA、T-AOC。测定采用上海常斤生物科技有限公司的酶试剂盒，方法按照说明书进行。

1.3 数据处理

实验所得数据用SPSS19.0进行单因素方差分析，各组间的比较采用Tukey方差检验。实验数据用“平均值±标准差”表示，P＜0.05表示差异显著。

2 结果与分析

泥鳅肝脏CAT活性随着硒化壳聚糖浓度的升高而增加（图1）。当硒化壳聚糖浓度高于0.6%时，CAT活性显著高于空白组和0.3%添加组（P＜0.05），而空白组和0.3%添加组之间没有显著差异（P＞0.05）。从图2中可以看出各实验组的GPX活性均显著高于空白组（P＜0.05），而各实验组之间没有显著差异（P＞0.05）；从图3中可以看出SOD活性在0.3%添加水平与空白组差异不显著（P＞0.05），但当硒化壳聚糖的添加水平高于0.3%时，SOD活性均显著高于空白组（P＜0.05），并在硒化壳聚糖浓度为1.2%时达到最高值，并显著高于其他实验组（P＜0.05）；从图4中可看出，MDA含量随硒化壳聚糖含量的增加而呈明显下降趋势（P＜0.05）；实验组MDA含量均显著低于对照组（P＜0.05），且在硒化壳聚糖浓度为1.2%时达到实验最低值；最后，从图5中可以看出实验组的TAOC明显高于空白组（P＜0.05），并在0.9%和1.2%添加水平时显著高于0.3%和0.6%添加水平（P＜0.05）。

图1 硒化壳聚糖对泥鳅肝脏过氧化氢酶（CAT）活性的影响Fig.1 Effect of seleno-chitosan on catalase activity of loach

图2 硒化壳聚糖对泥鳅肝脏谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）活性的影响Fig.2 Effect of seleno-chitosan on glutathione peroxidase activity of loach

图3 硒化壳聚糖对泥鳅肝脏超氧化物歧化酶（SOD）活性的影响Fig.3 Effect of seleno-chitosan on superoxide dismutase activity of loach

图4 硒化壳聚糖对泥鳅肝脏丙二醛（MDA）含量的影响Fig.4 Effect of seleno-chitosan on the malonicdialdehyde content of loach

图5 硒化壳聚糖对泥鳅肝脏总抗氧化活性（T-AOC）的影响Fig.5 Effect of seleno-chitosan on total antioxidant activity of loach

3 讨论

硒是人体所必需的微量元素，具有抗肿瘤等多方面的功能[14-15]，多糖是一种广谱的免疫增强剂，能够增强人体的免疫功能[16]。多聚糖硒作为补硒剂具有良好的稳定性和溶出性，而且在释放出硒后，配合体多糖不会产生毒副作用，同时还能促进金属离子的吸收和利用[17]。作为一种饲料添加剂，硒化壳聚糖已广泛用于畜牧业生产中，如ARTHINGTON[18]研究表明，肉用阉牛日粮中添加硒时其血浆中谷胱甘肽过氧化物酶活性有明显升高。在水产中关于硒化壳聚糖也有相关研究，如王宜艳等[13]在对栉孔扇贝血细胞的研究中已证实硒化壳聚糖可显著的提高栉孔扇贝中血细胞中参与抗氧化的CAT活性。因此，利用有机硒或者硒多糖来提高养殖动物的抵抗能力来达到防御疾病的效果，越来越得到养殖研究者的重视。同样，本研究也发现硒化壳聚糖显著提高了泥鳅的抗氧化能力，尤其是在硒化壳聚糖浓度达到0.9%时，抗氧化能力达到最高。

泥鳅的抗氧化能力与体内的SOD、CAT、GPX活性以及MDA含量密切相关。本研究中，泥鳅肝脏的GPX活性与硒化壳聚糖浓度呈高度正相关。ROTRUCK，et al[19]研究表明硒作为GPX的重要组成部分，硒的添加可提高GPX的活性。酶活性的提高可增强清除自由基的能力，保护机体组织免受氧化损伤。过氧化物是机体代谢过程中产生的废物，对机体内的器官会造成损害。而CAT是一种催化过氧化氢分解为氧和水的酶，在抗氧化系统中具有重要作用。从本研究结果的图1中可以看出CAT的活性随硒化壳聚糖浓度的增加而提高。GPX与CAT的作用相似，因此，GPX含量的多少，也可用于衡量机体抗氧化能力大小[20]。在对虹鳟Oncorhynchus mykiss[21]、斑点叉尾鮰Ictalurus punctatus[22]、皱纹盘鲍Haliotis discus hannai[23]和点带石斑鱼Epinephelus malabaricus[24]的研究中发现，随着硒在动物体内的积累，GPX的活性显著提高，这与本研究结果一致，即泥鳅GPX的活性随硒化壳聚糖的浓度的增加而增加。SOD是机体抗氧化体系中的重要成员，与GPX协调发挥作用，阻止氧自由基的链式反应。所以，SOD的活性可以相对的反映出硒在体内清除自由基的程度[25]。但是在图3中，硒化壳聚糖对SOD活性的影响呈波浪式。徐辉碧等[26]报道当硒超出一定浓度范围时，活性氧自由基数量随硒的浓度增大而增多，表现为生物毒性作用。在0.3%时，SOD的活性并没有得到明显改善，在高于0.3%时酶活有所明显改善,说明硒化壳聚糖对SOD的促进作用只在一定范围内。

MDA是机体不饱和脂肪酸发生脂质过氧化的产物，其含量变化是机体内脂质过氧化的重要指标，可反映机体的氧化损伤程度[27]。我们在实验中发现MDA含量随着硒化壳聚糖浓度的增加整体呈现下降趋势，说明硒化壳聚糖对MDA具有抑制作用。苏传福[28]研究发现日粮硒含量为0.66 mg/kg时可以显著降低草鱼Ctenopharyngodon idellus幼鱼肝脏和血清的MDA含量，有效的抵抗氧化损坏。总抗氧化能力可反映机体抗氧化酶系统以及机体自由基代谢状况，是衡量机体抗氧化系统功能状况的一个综合指标[29]。杨凡等[30]的研究表示，水生动物饲料中添加酵母硒显著提高动物的生产性能，增强动物机体的总抗氧化能力。苏传福[28]在草鱼幼鱼中添加硒发现草鱼总抗氧化能力明显提升。本实验研究结果显示，添加硒化壳聚糖可以提高泥鳅的总抗氧化能力，可能是因为硒化壳聚糖提高了SOD、CAT和GPX等酶的活性。但是硒化壳聚糖的浓度在1.2%时，出现下降的趋势，可能由于高浓度的硒所表现出的毒性所致。

目前国内对水生动物日粮中添加硒化壳聚糖的研究较少，但在酵母硒的添加应用上有不少研究。曹丹等[31]在酵母硒添加对暗纹东方鲀Takifugu obscurus生长的研究中发现，添加了酵母硒的试验组的生长基本高于对照组。常仁亮等[32]使用酵母硒替代部分鱼粉用于中国对虾Fenneropenaeus chinensis养殖，结果显示含酵母硒的实验组的养殖效果高于对照组。在王井亮等[33]、徐有卿等[34]的研究中都显示了相似的结果。从这些研究中可以推出在饲料中添加硒化壳聚糖对泥鳅的养殖不仅不会产生副作用，还会促进泥鳅的生长，提高养殖泥鳅的品质。

本实验中，硒化壳聚糖的添加能够增强CAT、GPX和SOD的活性，减少MDA含量，提高总抗氧化能力，从而增强泥鳅的免疫力，促进了泥鳅的健康生长。已有研究表明[35]，无机硒在动物肝脏中是被动吸收的，而硒蛋白氨基酸等有机硒是主动吸收的。根据这些研究结果，我们推测硒化壳聚糖类似于多糖，这样更有利于被吸收，具有较高的生物利用率，故排泄物中含硒量少，有利于减少污染，保护环境，前景更广阔。

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