二氢黄酮GSUN-703抗抑郁、抗炎及抗镇痛作用研究

孙昕皓，金晴昊，夏亚男，符志杨，綦宇轩，曲有乐，关丽萍

（浙江海洋大学食品与医药学院，浙江舟山 316022）

抑郁症是一种典型的精神疾病。抑郁症患者主要表现为心情沉重，对工作生活丧失兴趣，精神疲乏，对生活琐事力不从心，生活态度悲观消极，内心痛苦，常感到绝望，严重影响了他们日常的工作与生活，也给家人及社会带来了一定的负担。据WHO预测到2020年，抑郁症将成为威胁人类生命健康的第二大杀手[1-3]。

研究表明，抑郁可能与体内的炎症和疼痛有关，炎症和神经性疼痛都可能诱导患者罹患抑郁症，而且重度抑郁患者会出现疼痛和炎症加重的现象。MAES，et al[4]发现重症抑郁症患者的机体，处于血浆阳性急性期蛋白升高和阴性急性期蛋白降低的炎性状态，体内所感染的炎症的发生，通过脑内的细胞介质IL-1使得动物和人体表现出厌食发热、活动减少、情绪低沉等“病态行为”。CAPURON，et al[5]研究表明，周围炎症反应可以诱导患者神经病理性疼痛和抑郁合并症。用IFN-α给丙型肝炎或恶性黑色素瘤患者给予系统性治疗后，患者出现抑郁症状的，其中45%的患者可发展成重度抑郁障碍。

慢性应激是慢性疼痛的一种显著性特点，人脑中枢神经递质5-HT和NA的释放紊乱程度也与疼痛应激持续的时间和力度有关，而5-HT及NA在脑中含量的降低可导致抑郁样症状。BAIR，et al[6]研究表明，30%～60%的慢性疼痛患者临床伴有抑郁症状。抑郁症患者也表现出体内慢性疼痛的临床症状（头痛、背痛等）。MILLER，et al[7]研究表明，慢性疼痛患者经由影像学可检测到其蓝斑结构发生改变，可能趋使疼痛患者出现焦虑、悲观痛苦、情绪低沉的抑郁样行为，并且与疼痛本身引发的厌恶情绪相比，这种长期应激于神经病理性疼痛而诱导出的抑郁表征更为明显。

近年来，有关黄酮类化合物的抗抑郁作用陆续有了研究报道。如郑莉等[8]从贯叶金丝桃中分离得到的槲皮苷，体外实验能抑制单胺氧化酶A的活性，具有潜在的抗抑郁作用。王卫星等[9]认为金丝桃苷等10个天然黄酮类化合物的具有不同程度的缩短小鼠强迫游泳时间，显示不同程度抗抑郁活性。龚乃超等[10]发现从鱼腥草中提取的黄酮物质抗抑郁效果优于抗抑郁药氯丙咪嗪。

课题组研究发现二氢黄酮化合物GSUN-703（其结构如图1）（10 mg/kg剂量）能显著抑制小鼠强迫游泳不动时间，显示一定的抗抑郁活性。本研究对化合物GSUN-1601采用经典抗抑郁模型“小鼠强迫游泳实验”和“小鼠悬尾实验”进行不同剂量研究，同时，对化合物进行抗炎和抗镇痛研究，以期探讨抗抑郁与炎症和疼痛之前的关系，初步探讨其作用机制，为抗抑郁的研究提供理论依据。

图1 二氢黄酮化合物GSUN-703结构Fig.1 The structure of compound GSUN-703

1 实验方法

1.1 实验仪器与试剂

WRS-1B数字熔点仪（上海精密科学仪器有限公司），FT-IR1730红外光谱仪（Bruker公司），AV-300核磁共振光谱仪（Bruker公司），HP1100LC/MS质谱仪（美国惠普公司），BS323S精密天平（赛多利斯科学仪器有限公司）。氟西汀，吲哚美辛，2，4-二羟基苯乙酮，2，4-二氯苯甲醛，无水乙酸钠购自Sigma公司。其它化学试剂均为国产分析纯。

1.2 实验动物

小鼠（ICR）20±2 g，购于浙江省医学高等专科学校。

1.3 GSUN-703的合成路线

反应条件：

（i）prenyl bromide,anhydrous K2CO3;（ii）aromatic aldehyde,KOH;（iii）EtOONa.

1.3.1 2-羟基-4-异戊烯氧基苯乙酮的制备

在100 mL圆底烧瓶中分别加入2，4-二羟基苯乙酮0.50 g，0.95 g无水碳酸钾，40 mL无水丙酮，50℃下反应1 h。缓慢滴加入溴代异戊烯（0.64 g加入2 mL无水丙酮中），回流3 h。TLC跟踪反应直至原料点消失，停止反应。滤除碳酸钾，并用丙酮淋洗。合并滤液，蒸除丙酮，以石油醚/乙酸乙酯=20:1柱层析，得白色固体。

1.3.2 2-羟基-4-异戊烯氧基-2′，4′-二氯查尔酮的制备

在100 mL圆底烧瓶中加入2-羟基-4-异戊烯氧基苯乙酮0.50 g，2,4-二氯苯甲醛0.5 g，在氮气流保护下，边搅拌边滴加由4.90 g KOH和44.0 mL无水乙醇配成的14%的KOH溶液，室温搅拌10 h。TLC跟踪反应直至原料点消失，停止反应。将反应液倾倒入冰水中，用HCl调pH至中性，用乙醚萃取。合并乙醚层，蒸除乙醚，以石油醚/乙酸乙酯=20:1柱层析，得到黄色针状晶体2-羟基-4-异戊烯氧基-2′，4′-二氯查尔酮[11-12]。

1.3.3 7-异戊烯氧基-2′，4′-二氯-2，3-二氢黄酮（GSUN-703）的制备

在圆底烧瓶中加入2-羟基-4-异戊烯氧基-2′，4′-二氯查尔酮0.50 g，无水乙酸钠0.80 g及无水乙醇40 mL，回流10 h。蒸除乙醇，加水，用乙醚萃取。合并乙醚层，蒸除乙醚，石油醚/乙酸乙酯[V（石油醚）/V（乙酸乙酯）]=20:1柱层析，得白色固体二氢黄酮GSUN-703。

1.4 强迫游泳实验（FST）

雄性小鼠，实验前正常饮水和进食，随机分组，每组8只。二氢黄酮GSUN-703溶解在DMSO中，以1，5和10 mg/kg剂量腹腔注射给药，氟西汀（10 mg/kg）注射30 min后，将小白鼠单只放入高为20 cm，直径为14 cm，水深为10 cm，温度为（25±2℃）的圆柱形玻璃容器中，观察6 min。记录实验后4 min内的不动时间（小鼠浮在水面上不动或仅仅轻微划动肢体以确保头部浮在水面上所花费的时间为小鼠的不动时间）[13]。采用SPSS13.0软件对数据进行统计分析，组间比较用t检验，P＜0.05为具有统计学意义。

1.5 悬尾实验（TST）

将小鼠尾部距离尖端2 cm处用尾巴夹钳固定，悬挂于支架上，头部距离台面5 cm。实验环境在黑暗，无明显噪音。小鼠悬浮6 min，记录后4 min的小鼠不动的持续时间（小鼠的不动时间为它们被悬挂后彻底静止不动的时间）[14-15]。采用SPSS13.0软件对数据进行统计分析，组间比较用t检验，P＜0.05为具有统计学意义。

1.6 抗炎实验

二氢黄酮GSUN-703和吲哚美辛溶于聚乙二醇-200中，小鼠随机分组，每组8只。给药组分别以10 mg/kg剂量下腹腔注射给药，按照0.1 mL/20 g。给药0.5 h后，小鼠左耳内外两面涂抹二甲苯，用量为0.05 mL/20 g为实验组；右耳朵不涂抹，作为对照组[16-17]。炎症造模15 min后，颈脱臼处死小鼠，使用小鼠耳打孔机中直径6 mm的打孔模具分别在同一位置打下小鼠左右双耳的耳片。记录其质量，计算肿胀度和肿胀率。以左右两侧耳片重量差作为肿胀程度的指标，实验组与对照组的肿胀程度进行统计学处理，采用t检验进行组件比较，P＜0.05为有统计学意义。抗炎作用强度以肿胀率（%）和肿胀抑制率（%）表示。

肿胀度=左耳质量-右耳质量；肿胀率=[（左耳质量-右耳质量）/左耳重量]×100%。

1.7 镇痛实验

二氢黄酮GSUN-703和吲哚美辛溶于PEG-200中，以10 mg/kg剂量腹腔注射，小鼠随机分组，每组8只。注射体积为0.1 mL/20 g。给药30 min后，腹腔注射1.2%的冰乙酸生理盐水[18]，注射剂量为0.2 mL/20 g，观察15 min内小鼠出现的扭体现象的次数。小鼠出现扭体反应的现象为：四肢延伸，腹部收缩内凹，臀部扭转的一系列动作。按照公式统计药物在醋酸致痛模型中对小鼠扭体反应的抑制率和镇痛百分率。抑制率%=（空白组扭体次数均数-给药组扭体次数均数）/空白组扭体反应均数×100%；镇痛百分率%=（给药组无扭体反应数-空白组无扭体反应数）/空白组扭体反应数×100%。

2 结果与讨论

2.1 二氢黄酮GSUN-703光谱数据

对目标化合物采用IR、1H-NMR、13C-NMR和MS确定结构，产率和光谱数据为，产率 66.7%.1H-NMR（CDCl3,300 MHz）:1.66（s,3H,-CH3）,1.70（s,3H,-CH3）,2.71（d,2H,-CH2）,2.80（t,1H,-CH）,4.50（d,2H,-CH2）,5.41（t,1H,=CH）,6.40-6.57（m,3H,-C6H3）,7.30-7.71（m,3H,-C6H3）.13C-NMR（CDCl3,75 MHz）:18.3,25.8,42.9,65.3,76.2,101.7,111.0,114.5,118.8,127.9,128.6,129.3,132.2,134.6,135.5,138.8,160.9,163.1,165.5,189.3.IR （KBr）cm-1:2927,2915,1675,1446,1259,962.MS （M+1）:377.

2.2 GSUN-703抗抑郁活性

二氢黄酮GSUN-703小鼠强迫游泳实验结果见表1，二氢黄酮GSUN-703能明显的抑制小鼠强迫游泳的不动时间，在3种剂量下（1、5和10 mg/kg）。其中，在10 mg/kg剂量下其抑制率为64.2%，与氟西汀抑制率相似（67.6%）。显示一定的抗抑郁活性。

表1 GSUN-703小鼠强迫性游泳实验数据Tab.1 Evaluation of the antidepressant activity of GSUN-703 in the FST in mice

二氢黄酮GSUN-703小鼠悬尾实验结果见表2，二氢黄酮GSUN-703能明显的抑制小鼠强迫游泳的不动时间，在3种剂量下（1，5和10 mg/kg）。其中，在10 mg/kg剂量下其抑制率为54.1%，与氟西汀抑制率相似（57.5%），显示一定的抗抑郁活性。

表2 GSUN-703小鼠悬尾实验数据Tab.2 Evaluation of the antidepressant activity of GSUN-703 in the TST in mice

2.3 GSUN-703抗炎、抗镇痛活性

采用小鼠耳肿胀模型和醋酸致痛模型进行小鼠的抗炎活性和镇痛活性评价：实验结果表明，化合物GSUN-703在10 mg/kg的给药剂量下，与空白组相比具有显著性差异（P＜0.01），显示出一定的抗炎与镇痛活性。化合物GSUN-703的抗炎率为77.5%，镇痛率为70.4%。其抗炎镇痛活性仍低于阳性对照药吲哚美辛。

表3 GSUN-703抗炎和止痛活性数据Tab.3 In vivo anti-inflammatory and analgesic activities of GSUN-703

强迫游泳实验和悬尾实验被动接受抑郁症的两个经典的应激模型，从而诱发动物绝望的状态，在小鼠中实验具有良好的可靠性和预测性。已知现在的多种抗抑郁药可以在强迫游泳实验和悬尾实验这两个“行为绝望状态”实验中减少小鼠的不动时间[19-20]。

在本研究中，实验结果显示化合物GSUN-703在3种剂量下（1、5和10 mg/kg）显著的抑制小鼠强迫游泳和小鼠悬尾的不动时间，显示一定的抗抑郁活性。其中，GSUN-703在10 mg/kg剂量下其抑制率为64.2%（FST）和抑制率为54.1%（TST），与氟西汀抑制率相似。另外，化合物GSUN-703在10 mg/kg的给药剂量下，与空白组相比具有显著性差异（P＜0.01），显示出一定的抗炎与镇痛活性。化合物GSUN-703的抗炎率为77.5%，镇痛率为70.4%。推断化合物GSUN-703的抗抑郁作用机制，可能是通过炎症免疫假说的细胞介质传导或与疼痛抑郁合并症机制有关，起到抗抑郁疗效。

3 结论

以市售的2，4-二羟基苯乙酮为起始原料，经过Williamson反应、克莱森—斯密特缩合、亲核取代和Michael反应，获得目标化合物二氢黄酮GSUN-703。对目标化合物采用红外光谱、核磁共振光谱和质谱确定了其结构。

采用经典抗抑郁模型“小鼠强迫游泳实验和小鼠悬尾实验”，对GSUN-703进行抗抑郁活性研究，实验结果显示，GSUN-703小鼠腹腔注射1、5和10 mg/kg的给药剂量下，能明显的抑制小鼠强迫游泳和小鼠悬尾的不动时间，显示一定的抗抑郁活性。

采用小鼠耳朵涂抹二甲苯致炎模型和小鼠注射冰乙酸致疼痛模型，对GSUN-703进行抗炎和镇痛活性研究。实验结果表明，小鼠腹腔注射10 mg/kg剂量的GSUN-703，与空白组相比具有显著性差异（P＜0.01），显示出一定的抗炎与镇痛活性。此结果初步推断二氢黄酮GSUN-703的抗抑郁作用机制，可能是通过炎症免疫假说的细胞介质传导或与疼痛抑郁合并症机制有关。

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