大肠癌筛查技术的研究进展

安 太，马 莹，刘 琰，袁东红，史盛梅，孟存英，张治星，张金强

大肠癌筛查技术的研究进展

安 太，马 莹，刘 琰，袁东红，史盛梅，孟存英，张治星，张金强

结直肠肿瘤；筛查；结肠镜

大肠癌又称结直肠癌，是一种多基因参与、发病及死亡率均呈上升趋势的常见恶性肿瘤，早期诊断率和预期生存率低，是影响人类健康及寿命的重要原因之一。世界卫生组织(WHO)的数据显示，2012年全球大肠癌新发及死亡病例分别居恶性肿瘤第3位、第4位[1]。尽管粪隐血试验(FOBT)、结肠镜等传统筛查技术已广泛应用，但因FOBT的漏诊率较高，结肠镜为有创性检查，且穿孔等并发症多，使无创粪便脱落细胞技术得以推广，其脱落细胞提取程序复杂繁琐，结果受多因素影响。近年研究者以人体生物样本(如尿液、排泄物、血清、病变组织等)为研究对象，探索从分子水平筛查大肠癌的新技术层出不穷，其中以基因研究为热点的筛查技术，有高敏感性及特异性，本文就大肠癌筛查技术最新研究进展综述如下。

1 细胞筛查技术

目前活组织病理检查(活检)仍是诊断大肠癌的金标准，但如何早期发现、早期诊断是临床急需解决的首要问题。以反向间接血凝法或酶联免疫吸附法为代表的FOBT检测2次，≥1次阳性者，联合传统结肠镜、染色放大内镜、窄带成像技术及富士能智能染色内镜技术等方法可直观并多点钳取病变组织；对结肠镜检查有禁忌证者，结肠气钡双重造影、CT仿真肠镜(CTC)等技术亦可发现病变部位，进而经活检从细胞水平确定病变的病理类型，逐渐提高大肠癌的早期诊断率。

传统检测技术的特异性及敏感性均较低，受有创性及并发症的局限，促使研究者试图从粪便的大肠脱落细胞中发现癌细胞,该方法从最早提出到Fearon等[2]深入研究，历经半个多世纪使学术界重新认识了大肠脱落细胞的价值，其可直接经病理镜观察脱落细胞的形态学特点以区分癌细胞。若患者存在手术、外伤等肠黏膜损伤因素，可能会增加大肠癌脱落细胞种植转移的风险[3]，而对粪便脱落细胞的早期筛查可降低此类风险。

文献报道肿瘤的发展过程可改变患者免疫状态，尤其是T淋巴细胞功能状态的改变及循环肿瘤细胞的大量出现[4]。有研究者采用流式细胞仪测定大肠癌患者外周血T淋巴细胞亚群CD3+、CD4+和自然杀伤细胞的数量及比值，判定其与淋巴结转移的相关性及病理分期[5]。Lu等[6]应用免疫磁珠阴性选择法结合流式细胞仪分离及鉴定大肠癌循环肿瘤细胞(CTCs)，以小鼠免疫球蛋白G1κ为同型对照，发现人结肠癌(HCT116)细胞平均回收率为61%或更高，其相关系数为0.992，进一步分析18例大肠癌的血液样本，以血液中(33±24)CTCs/10 ml和直径14～20 μm的CTCs为标准,阳性率达94.4%，证明检测CTCs有利于早期发现癌细胞，为大肠癌患者提供一种新的敏感性及特异性均较好的分离CTCs新技术，可能有助于预测大肠癌的进展及选择适当的治疗方法。

2 分子检测技术

从细胞水平诊断大肠癌有其不足之处和局限性，且传统治疗手段效果不甚理想，易复发及转移，因此从分子水平寻求早期诊断大肠癌的方法及提高治疗效果的新手段迫在眉睫。

2.1 非核酸类分子

2.1.1 非组织中非核酸类分子：目前关于大肠癌相关肿瘤标志物的种类繁多，非核酸类分子包括蛋白类复合物(CA125、CA242、CA199等)、酶类(端粒酶-TLMA、基质金属蛋白酶-MMPs)、激素类(胃泌素、VEGF等)，以癌胚抗原(CEA)、CA125、CA199及CA242为临床最常用的检测指标。传统方法检测CEA对大肠癌的诊断率较低。Yang等[7]用涂有高品质的磁性纳米粒子CEA抗体测定血清CEA浓度，临界值为4.05 ng/ml时，其灵敏性为90%，特异性为87%，有助于大肠癌早期诊断。Zhu等[8]研究大肠癌患者外周血单核细胞人类白细胞抗原A基因mRNA(HLA-A mRNA)表达的诊断价值，与CEA、CA199和CA242比较，其敏感性、特异性分别为81%、75%，明显高于CA242(63%、67%)、CEA(59%、64%)、CA199(61%、52%)，且CA242的敏感性和特异性优于后两者。有研究证实多种标志物联合检测可提高大肠癌检出率。Pengjun等[9]采用多因素Logistic回归分析，结果显示CEA、CA199、白细胞介素(IL)-8、肿瘤坏死因子(TNF)-α和MMP-7联合检测对大肠癌诊断的敏感性和特异性分别为85.86%、96.78%，表明3种血清细胞因子(IL-8、TNF-α和MMP-7)联合CEA和CA199检测大肠癌可能具有强大的潜力。

2.1.2 组织中非核酸类分子：研究表明大肠癌细胞可高表达p53、APC、Survivin、雷帕霉素靶蛋白mTOR等多种蛋白，同时粪便脱落细胞表达与大肠癌相关的蛋白如p53、钙卫蛋白等[10-14]。有文献报道测定血清中部分细胞表面因子(如CD26、CD44等)及蛋白(如Survivin、骨桥蛋白等)有助于大肠癌的早期诊断[15-19]。

基因的异常表达对促进肿瘤的形成及发展至关重要。Survivin基因是凋亡抑制基因家族中分子量最小、抗凋亡能力最强的肿瘤相关基因，是肿瘤凋亡系统中的共同靶点，与p53、AKT、PTEN等多种基因共同调控肿瘤的发生、发展。Choi等[20]研究MAGE和SSX、相关的COX2、VEGF及Survivin基因在大肠癌中的表达，对37例结直肠腺癌新鲜组织标本进行分析，结果显示MAGE和SSX表达率分别为51.4%、32.4%，Survivin基因表达率达83.3%；MAGE和SSX与肝转移和Survivin基因的表达密切相关，与COX2、VEGF和其他临床病理变量的表达无显著相关性。有研究表明Survivin基因参与了大肠癌的发生、发展，其多态性的表达增加了大肠癌发生的风险[21]，可成为早期诊断大肠癌的一种生物标志物和潜在的治疗靶点。

细胞因子信号转导抑制因子(SOCS)家族是通过抑制细胞因子依赖的酪氨酸激酶Janus激酶(JAK)-信号转导及转录激活因子(STAT)信号通路，进而抑制某些生长因子和细胞因子应答的一类蛋白，包括CISH及SOCS1-7。最新研究表明在大肠癌癌前病变及癌变细胞中一些蛋白质，特别是SOCS2和SOCS6显著减少，促进了细胞生长及增殖，显著缩短了早期大肠癌的无病生存期，可早期预测肿瘤的严重程度[22]，可能成为大肠癌早期诊断的敏感生物标记物，但其有待于进一步的研究探讨。

研究证实肿瘤组织中极少量的肿瘤干细胞参与了肿瘤的形成[23]，为肿瘤早期诊断提供了一种筛查及治疗的新途径。以Bmi-1基因为代表的肿瘤干细胞，是多梳基因(PcG)家族成员之一，是位于人体10号染色体断臂13区的一种重要调控基因[24]，血液肿瘤和多种实体瘤多表达此基因，与细胞生长增殖、干细胞自我更新、肿瘤分化程度、淋巴结转移、Duke分期、浸润深度、放化疗抵抗性等密切相关[25]，与c-myc基因共同促进细胞增殖和抑制细胞衰老。邹艳芳等[26]探讨Bmi-1和Mel-18基因在大肠癌组织中的表达及意义，发现Bmi-l基因在大肠癌组织中的表达明显高于正常组织，与大肠癌的淋巴结转移、浸润深度及Duke分期紧密相关；Mel-18基因在大肠癌组织的表达则明显低于正常组织,与大肠癌的淋巴结转移及Duke分期呈负相关，为大肠癌的诊断及预后评估提供了一条新途径。

2.2 核酸类分子 大肠癌是内外环境的异常变化打破了原癌基因激活与抑癌基因失活的平衡，经多步骤、多基因的长期累积发生、发展而成[27]，因此以基因为研究主体的试验如火如荼地开展，可能为大肠癌的早期诊断及治疗提供新的突破点，突显基因诊断的优势，提高大肠癌早期诊断率，降低病死率。

2.2.1 DNA：研究发现大肠癌相关基因分为原癌基因(K-ras、c-myc、cyclinDl等)和抑癌基因(p53、APC、SEPT9、PTEN等)，大肠癌组织、血清及粪便中均可检测到该类基因，其突变、缺失、高表达或低表达的人群均易患大肠癌[28]。研究证实粪便大肠癌脱落细胞表达p53、APC、K-ras等突变基因，但诊断灵敏性均不足40%[29]。Kalimutho等[30]研究发现粪便DNA检测诊断大肠癌敏感性(86%)和特异性(81%)较联合免疫粪便隐血试验(IFOBT)的敏感性(89%)和特异性(95%)明显降低。钟选芳等[31]联合IFOBT、PCR-SSCP方法检测粪便中APC、p53和K-ras基因，结果显示大肠癌组粪便IFOBT阳性率为45.7%，APC、p53、K-ras突变率分别为58.7%、65.2%、60.9%，两者联合检测的敏感性高于单种方法，可提高大肠癌筛查的效率，有望成为大肠癌机会性筛查的一种早期诊断及筛查的有效方法。

2.2.2 DNA甲基化：人体正常组织可发生DNA甲基化，以S-腺苷甲硫氨酸(SAM)为甲基供体，通过DNA甲基转移酶(DNMT)的甲基转移，作用于真核生物基因组胞嘧啶和鸟嘌呤(CpG)岛的胞嘧啶第5位碳原子，生成5-甲基胞嘧啶(m5C)；CpG岛甲基化与胚胎发育、某些等位基因的特异性失活有关。若基因组整体甲基化与特异性基因启动子区域CpG岛甲基化水平出现此消彼长的现象，有助于早期肿瘤的发生、发展，在患者的粪便或血清中可发现异常DNA甲基化，因此DNA甲基化检测技术可为大肠癌早期诊断开辟新途径。

研究证实可发生DNA甲基化的基因包括SEPT9、SNCA、FBN1、Survivin等基因，其中SEPT9基因广泛存在于人类细胞染色体17q25.3，在大肠癌的发生、发展过程中常被甲基化，甲基化率≥90%。目前中国食品药品监督管理局(CFDA)已批准SEPT9基因甲基化检测用于早期大肠癌的筛查，其敏感性为74.8%，特异性为97.5%。改进后第二代技术优于第一代，敏感性为79.3%～95.6%，特异性为84.8%～99%[32]。Jin等[33]研究第二代甲基化SEPT9试剂检测大肠癌，发现其敏感性和特异性分别为74.8%、87.4%，优于免疫化学试验检测粪便血红蛋白(FIT)(58%、82.4%)，且SEPT9阳性Ⅰ期为66.7%，Ⅱ期为82.6%，Ⅲ期为84.1%，Ⅳ期为100%，对晚期腺瘤敏感性为27.4%，提示SEPT9基因在大肠癌的筛查和早期诊断中发挥重要作用。此外，SEPT9基因也是预测大肠癌复发和生存的独立因素。最新研究探讨SNCA和FBN1甲基化对大肠癌的诊断价值，发现两者至少一个阳性时其联合检测的敏感性为84.3%，特异性为93.3%，尤其是Dukes A期敏感性和特异性显著高于FOBT阳性率，可能对大肠癌检测提供一个简单、有前景的选择[34]。

2.2.3 RNA及mi-RNA谱：修饰核苷是RNA的代谢产物，属内源性小分子，是一种广谱的潜在肿瘤标志物，利用高效液相色谱和质谱法(HPLC-MS)进行尿修饰核苷定性定量分析已逐渐成为研究热点。肿瘤患者尿液中修饰核苷显著高于正常人。Hsu等[35]应用HPLC-MS技术检测台湾乳腺癌患者的尿肌苷，其灵敏性、特异性均达62%；另一研究发现尿腺苷、胞苷、3-甲基胞苷、1-甲基腺苷、肌苷和2-脱氧鸟苷诊断大肠癌的灵敏性为14%～69%，六种核苷的灵敏性为37%～69%，尿核苷与CEA结合可提高大肠癌的诊断灵敏性[36]。Feng等[37]通过反相高效液相色谱法分析尿核苷的主要成分，发现该方法对大肠癌组尿修饰核苷检测的灵敏性显著高于CEA(38.5%)、CA-199(40.4%)、CA125(15.4%)和AFP(17.3%)。总之，修饰核苷可能成为高特异性和敏感性新的潜在肿瘤标志物，有助于大肠癌的临床诊断、治疗和随访。

近年研究发现mi-RNA水平在血清中较稳定，其水平变化与大肠癌的发生、发展、预后等密切相关[38]，同时发现miR-21、miR-34a、miR-34b/C、miR-135等表达谱的改变，在肿瘤的发生、发展中发挥重要调控作用[39-40]，有可能成为另一种潜在的新的肿瘤标志物。Wu等[40]研究粪便样品中miR-34a、miR-34b/C对大肠癌的诊断价值，发现miR-34b/C敏感性(95%)和特异性(100%)优于miR-34a(76.8%、93.6%)，均可能被视为非侵入性筛查和诊断大肠癌的潜在生物标志物。

综上，大肠癌是多基因相互作用的结果，与基因结构和功能的改变密切相关。以细胞生物学、分子生物学为基础的筛查技术的发展，从结构和功能方面不断深入的系统阐述与大肠癌的关系。虽然目前研究结果较多，但仍难以确定高灵敏性及特异性的诊断标志物用于提高大肠癌的早期诊断率，今后有待于在以上研究基础上进一步探寻筛选大肠癌的新方法，优化筛查及治疗方案，提高早期诊断率。

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