甘草炮制雷公藤降低其肝毒性作用的初步研究

赵小梅+宫嫚+董捷鸣+王伽伯+肖小河+赵奎君+马致洁

[摘要]为探讨甘草炮制雷公藤降低其肝毒性的作用，动物实验评价炮制前后雷公藤对肝脏的毒性，观察空白组、雷公藤组、甘草炮制雷公藤组肝组织病理切片、血清生化指标及细胞炎症因子的差异。大鼠肝组织病理切片显示雷公藤组肝组织损伤明显，炮制后肝组织未见明显损伤；雷公藤组与空白组比较AST，ALT，CRE升高（P<001），UREA升高（P<005），ALB降低（P<001）；甘草炮制雷公藤组与雷公藤组比较AST，ALT，CRE，UREA降低（P<001），ALB升高（P<001）。炎症因子检测结果显示雷公藤组与空白组比较IL1β， IL6，TNFα显著升高（P<001）；甘草炮制雷公藤组与雷公藤组比较IL1β， IL6，TNFα显著降低（P<001）。甘草炮制雷公藤可有效降低雷公藤肝毒性，减轻雷公藤导致的肝损伤。该实验可为雷公藤合理制用提供参考，同时为甘草炮制雷公藤降低其肝毒性研究提供数据支持。

[关键词]雷公藤； 甘草； 炮制减毒； 肝毒性； 炎症因子

雷公藤Tripterygium wilfordii Hook F为卫矛科雷公藤属一年生藤本植物，最早记载于《神农本草经》，味苦、辛，性寒，有大毒，归肝、肾经。具有祛风除湿、舒筋活络、消肿止痛、杀虫解毒等功效。在临床上治疗类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、红斑狼疮、肾病综合征等自身免疫系统疑难病症有良好的效果，疗效独特[12]，但由于雷公藤毒性较大，临床应用时不良反应时有发生，包括肾脏、生殖系统、肝脏、胃肠道、免疫系统及皮肤黏膜等，其中肝脏为其最常见的受累器官之一[34]，已严重制约其临床应用。

历代文献对雷公藤炮制减毒方法的记载甚少，现代对其炮制的研究方法有净制、蒸制、加辅料（羊血）、灵芝双向发酵解毒等[57]，目前临床应用时，主要是对雷公藤进行净制，取毒性较小的木质部作为药用，但中毒及不良反应现象仍很突出。雷公藤加热炮制和辅料炮制减毒的现代研究也较少，且减毒效果不明显。现代研究表明，甘草具有保肝作用，甘草酸是其主要作用成分[8]。文献记载甘草常用于有毒中药的配伍及炮制[8]，甘草汁炮制是传统减消中药毒性的手段，有文献报道甘草配伍雷公藤能显著降低肝毒性，且已优化了最佳配伍比例，从化学角度证实了雷公藤配伍甘草对毒性成分含量和比例的影响[911]。为此，本研究以肝毒性中药雷公藤为研究对象，在甘草配伍雷公藤减毒的实验研究和临床应用基础上，拟结合现代研究成果，研究甘草炮制雷公藤减毒的作用及效果，以期为临床提供安全、有效、便于使用的雷公藤炮制品，同时为其他肝毒性中药研究提供参考和数据支持。

1材料

旋转蒸发仪（RE52AA）；水循环真空泵（上海知信实验仪器技术有限公司）；AL204电子天平（METTLER TOLEDO）；Gradient A10 MillQ超纯水器（美国Millipore 公司）；超声提取清洗器（KQ5200E）；真空冷冻干燥箱；OLYMPUS光学显微镜；冷冻离心机（Sigma，德国）；低速离心机（SE3614）；自动生化仪（mindray BS300）；酶标仪；水浴锅（AISITE）；电磁炉。

雷公藤T wilfordii生药材购自福建三明，经首都医科大学附属北京友谊医院赵奎君教授鉴定，为卫矛科雷公藤的干燥根；生甘草饮片购自于北京友谊医院中药房，经赵奎君教授鉴定为豆科植物胀果甘草的干燥根。

无水乙醇，纯净水；天门冬氨酸氨基转氨酶检测试剂盒；丙氨酸氨基转氨酶检测试剂盒；血清白蛋白检测试剂盒（南京建成生物工程研究所）。

大鼠白介素1β酶联免疫试剂盒 （rat interleukin 1β ELISA Kit），批号（W07036997）；大鼠白介素6酶联免疫试剂盒 （rat interleukin 6 ELISA Kit），批号（W09036996）；大鼠肿瘤坏死因子α酶联免疫试剂盒（TNFα ELISA kit ），批号（U27036998）（Cusabio）。

2方法

21样品制备

211雷公藤提取物称取适量雷公藤生药材，打粉机打碎成粗颗粒状，8倍体积60%乙醇超声提取3次，合并滤液，减压浓缩回收乙醇，真空干燥得粗提物，雷公藤提取率为762%， 临用前用去离子水配制成相应浓度 （按雷公藤生药量配制）。

212甘草汁炮制雷公藤样品制备称取适量雷公藤生药材（打粉机打碎成粗颗粒状）及生甘草饮片，雷公藤甘草3∶1。

8倍体积的纯净水浸泡甘草饮片30 min，煎煮20 min，煎煮液滤出，相同步骤重复煎煮2次后合并滤液，浓缩至合适体积，甘草汁的量需能完全浸泡雷公藤，备用。

取制备好的甘草汁浸泡雷公藤生药材至甘草汁被完全吸收，置鼓风干燥箱干燥，取出后按211项提取，减压浓缩回收乙醇，真空干燥得粗提物，临用前用去离子水配制成相应浓度 （按雷公藤生药量配制）。

22动物分组

以下实验动物均由中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心提供，实验动物分笼饲养于解放军第三○二医院实验动物中心。每天上午 9∶00—10∶00 灌胃，正常组每天灌以等量生理盐水。

221小鼠预试验（给药剂量的确定） SPF级雄性小鼠50只，体重（20±2）g，正常饲养5 d，随机分成5组（n=10），空白组、低剂量组（3 g·kg-1）、中剂量组（6 g·kg-1）、高剂量组（12 g·kg-1）和超高剂量（24 g·kg-1）（以雷公藤生药材计），连续给药14 d。

222甘草汁炮制雷公藤減毒小鼠试验SPF级雄性小鼠30只，体重（20±2） g，正常饲养5 d，随机分成3组 （n=10），空白组、雷公藤组（15 g·kg-1）、甘草炮制雷公藤组（15 g·kg-1）（以雷公藤生药材计），连续给药14 d。

223甘草汁炮制雷公藤减毒大鼠试验SD大鼠，SPF 级，（180±20）g，30只，正常饲养5 d，随机分成3组（n=10），空白组、雷公藤组（15 g·kg-1）、甘草炮制雷公藤组（15 g·kg-1）（以雷公藤生药材计），连续给药14 d。

23肝组织病理形态学检查

取实验动物肝组织 05 cm×1 cm×15 cm，10%甲醛固定，常规病理切片，HE染色，光镜下观察，拍照。

24动物取血及血清处理

实验组小鼠及大鼠给药2周后在灌胃后1 d眼眶取血，冷冻离心（4 ℃，3 500 r·min-1，10 min），取上清，全自动生化及酶标仪检测AST，ALT，ALB，Cre，BUN，UREA。炎症因子IL1β，IL6，TNFα检测按照试剂盒说明进行。

25数据处理

采用 SPSS 180 软件统计，各项指标结果以±s描述，进行组间数据比较，若符合正态分布用完全随机设计资料单因素方差分析。两样本比较，其中方差齐性者采用LSD法检验，方差不齐者采用 Dulmets 法检验。

3结果

31不同给药剂量小鼠存活率

超高剂量组在第8 天所有实验小鼠已全部死亡，存活率为0%；高剂量组实验小鼠2周存活率为90%，中剂量组实验小鼠2周存活率为90%；低剂量组实验小鼠2周存活率为90%；空白组实验小鼠2周存活率为100%；因此实验组（小鼠实验及大鼠实验）给药剂量在高剂量组12 g·kg-1（以雷公藤生药材计）基础上提高为15 g·kg-1（以雷公藤生药材计）给药，结果见图1。

321小鼠肝组织病理切片（HE染色）空白对照组小鼠肝组织着色均匀、肝小叶结构清晰、肝索排列整齐、肝细胞形态完好。雷公藤组肝索排列明显紊乱，炎细胞浸润、结构破坏、 肝细胞浑浊、伴有大量水肿和脂肪变性，大量片状萎缩坏死、胞浆内有明显的大小不等的空泡以及数量不一的肝细胞凋亡现象；肝组织呈轻微嗜碱性。甘草炮制雷公藤组肝索排列轻度紊乱，肝细胞伴有少量水肿，肝细胞轻度退变，肝细胞形态完好。提示甘草炮制雷公藤可减轻其肝损伤程度，结果见图2。

322小鼠血清生化指标检测雷公藤组与空白组比较AST，ALT升高（P<005），CRE升高（P<001）；ALB降低（P<001），BUN没有明显差异；甘草炮制雷公藤组与雷公藤组比较AST，ALT，BUN没有明显差异，CRE降低（P<001）；ALB升高（P<005）；每组实际检测的动物数（n=8），结果见图3。

33甘草汁炮制雷公藤减毒大鼠实验结果

331肝组织病理组织形态学检查（HE染色）空白对照组大鼠肝组织着色均匀、肝小叶结构清晰、肝索排列整齐、肝细胞形态完好。雷公藤组肝索排列紊乱，肝细胞肿胀、浑浊、伴有少量水肿和脂肪变性少量坏死，结构破坏、局部区域出现炎性细胞浸润，肝细胞出现空泡和局灶性炎性。甘草炮制雷公藤组肝组织着色均匀、肝小叶结构清晰、肝索排列整齐、肝细胞形态完好，无明显肝损伤表现，结果见图4。

332大鼠生化指标检测雷公藤组与空白组比较AST，ALT，CRE升高（P<001），UREA升高（P<005），ALB降低（P<001）； 甘草炮制雷公藤组与雷公藤组比较AST，ALT，CRE，UREA降低（P<001），ALB升高（P<001）。提示甘草炮制雷公藤可显著降低其肝毒性；每组实际检测的动物数（n=8），结果见图5。

333大鼠血清细胞因子IL1β，IL6，TNFα检测雷公藤组与空白组比较IL1β，IL6，TNFα显著升高（P<001）；甘草炮制雷公藤组与雷公藤组比较IL1β，IL6，TNFα显著降低（P<001）；每组实际检测的动物数（n=8），结果见图6。

4结论

本研究首次实验证实甘草炮制雷公藤可减轻其导致的肝脏生化指标及细胞因子IL1β，IL6，TNFα升高的症状，减轻其肝损伤，为临床安全、有效、便于使用的雷公藤炮制品的使用提供参考和数据支持。雷公藤治疗自身免疫性疾病效果显著，雷公藤在治疗自身免疫等难治性疾病（如类风湿性关节炎、慢性肾炎、系统性红斑狼疮等）具有很好的疗效[12]，但同时表现出明显的肝毒性作用，而相应的合理用药措施没有得到充分重视和研究，严重制约了雷公藤临床疗效的发挥。甘草是常用解毒中药，甘草酸具保肝作用，甘草炮制是传统减消中药毒性的手段

并取得了很好的效果；另一方面，研究显示雷公藤配伍甘草能显著降低肝毒性，已优化了最佳配伍比例[911]。

基于以上研究本实验采用甘草炮制雷公藤，观察炮制前后其肝损伤差异，结果显示肝组织病理切片中雷公藤组产生明显的肝损伤，与空白组比较生化指标ALT，AST，ALB，Cre，UREA，细胞因子IL1β，IL6，TNFα，有显著性差异，提示雷公藤组产生肝损伤。甘草汁炮制雷公藤组肝组织病理切片没有产生明显的肝损伤；且较之雷公藤组生化指标ALT，AST，ALB，Cre，UREA，细胞因子IL1β，IL6，TNFα，有显著性差异，提示雷公藤炮制后可减轻其肝损伤并减少肝损伤导致的炎症因子的释放。实验中雷公藤组肝损伤表现明显，血清中细胞炎症因子释放高于其他2组，其可能与HMGB1 迁移有关[1315]。HMGB1的来源有2种，一是由当细胞的完整性被破环，HMGB1瞬时被动释放，二是在内毒素、IL1和TNF等的刺激下，由巨噬细胞、单核细胞活化后主动释放[16]。HMGB1可通过活化细胞的主动分泌和坏死损伤细胞的被动释放而进入细胞外，其诱导机体固有免疫启动炎症反应，表现出炎症因子的作用[1721]，发表在Hepatology的研究结果证明HMGB1是对乙酰氨基酚急性肝损害的关键因子之一[15]，雷公藤致肝损伤机制有待于实验进一步探讨研究及验证。甘草炮制雷公藤组没有明显的肝损伤表现其可能的原因是甘草酸对HMGB1的阻断作用。有文献报道甘草中的重要成分之一甘草酸可直接结合HMGB1，可作为HMGB1的拮抗剂[1315]；甘草具有保肝作用，抗炎作用，其主要成分甘草酸对肝脏具有保护作用[8]。甘草同時具有保肝和拮抗HMGB1的双重作用，其是否是降低雷公藤肝毒性的主要机制有待进一步实验验证。甘草对HMGB1免疫通路的调控为炮制雷公藤减毒提供了重要支持，课题组将在后期对其进行进一步实验探讨，以期初步探讨其可能的减毒机制。雷公藤主要成分雷公藤红素和雷公藤甲素既是其有效成分，又是其主要的毒性成分，与肝损伤有一定的相关性[12，19]，有实验报道从化学角度探索甘草配伍雷公藤对其毒性成分含量和比例的影响[9]，课题组在后期炮制减毒机制探讨实验中也将对其进行比较，以期为雷公藤临床合理及甘草炮制雷公藤降低其肝毒性研究提供制用参考和数据支持。

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[责任编辑孔晶晶]

2017年1月 第42卷第1期Vol42， No 1January， 2017

[收稿日期]20161028