阿苯达唑纳米微粉平衡溶解度和表观脂水分配系数的测定

张玉欣　陈蓓　王建华　赵军

[摘要] 目的 测定阿苯达唑纳米微粉在不同介质中的平衡溶解度以及表观脂水分配系数。 方法 采用高效液相色谱法测定阿苯达唑的浓度，采用摇瓶法测定阿苯达唑纳米微粉在不同极性溶剂和不同pH缓冲液中的平衡溶解度及表观脂水分配系数。 结果 不同极性溶剂中，阿苯达唑纳米微粉在甲醇中溶解度最大[（2564.28±38.73）μg/mL]，在水中的溶解度最小[（125.25±1.45）μg/mL]。在pH=1.2～6.8緩冲液中，阿苯达唑纳米微粉溶解度从（551.33±19.00）μg/mL下降到（155.84±5.52）μg/mL；在pH=7.0～7.8缓冲液中，溶解度从（137.53±4.87）μg/mL上升到（168.94±5.63）μg/mL。纳米微粉的表观脂水分配系数在pH=1.2～2.0条件下lgP在0～2之间，pH=5.0～7.8条件下lgP在3～4之间。 结论 本研究测定了阿苯达唑纳米微粉在不同介质中的平衡溶解度以及表观脂水分配系数，为预测该纳米微粉体内外吸收的改善奠定了基础。

[关键词] 阿苯达唑纳米微粉；平衡溶解度；表观脂水分配系数；高效液相色谱法

[中图分类号] R927 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2016）11（c）-0119-06

Determination of the equilibrium solubility and apparent lipid-water partition coefficient of Albendazole Nano-meter Powder

ZHANG Yuxin1，2 CHEN Bei2 WANG Jianhua2 ZHAO Jun2

1.Institute of Pharmacy of Xinjiang Medical University， the Xinjiang Uygur Autonomous Region， Urumqi 830011， China； 2.Department of Pharmacy， the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University， the Xinjiang Uygur Autonomous Region， Urumqi 830011， China

[Abstract] Objective To determine the equilibrium solubilities and apparent oil-water partition coefficients for Albendazole Nano-meter Powder in different medium. Methods HPLC was used to determine the concentration of Albendazole. Shake flask method was employed to determine the equilibrium solubility and oil-water partition coefficient of Albendazole Nano-meter Powder in the different polar solvents and different pH buffer. Results Among the different polar solvents， the solubility of Albendazole Nano-meter Powder in methanol was the largest [（2564.28±38.73）μg/mL]， and the solubility in water was the smallest [（125.25±1.45）μg/mL]. The solubilities of Albendazole Nano-meter Powder in the buffer solution of pH=1.2-6.8 decreased from （551.33±19.00） μg/mL to （155.84±5.52）μg/mL， and the solubilities in the buffer solution of pH=7.0-7.8 increased from （137.53±4.87） μg/mL to （168.94±5.63）μg/mL. The apparent oil-water partition coefficients of nano-meter powde were between lgP 0-2 under the condition of pH=1.2-2.0， and between lgP 3-4 under the condition of pH=5.0-7.8. Conclusion The study determined the equilibrium solubilities and apparent oil-water partition coefficients for Albendazole Nano-meter Powder in different medium. It has laid a basis for the predictions of absorption improvement in vitro and in vivo of Albendazole Nano-meter Powder.

[Key words] Albendazole Nano-meter Powder； Equilibrium solubility； Apparent oil/water partition coefficient； HPLC

阿苯达唑（albendazole，ABZ）又名丙硫咪唑，为苯并咪唑类广谱抗寄生虫药，其在抗棘球蚴领域卓越的疗效、毒性作用小以及药物经济学方面明显优于其他药物，成为细粒棘球蚴病药物治疗中的首选[1-2]，也是WHO推荐抗包虫病的一线药物[3-4]。但其在水和多数有机溶剂中不溶，影响了其体内吸收和生物利用度及抗包虫病疗效的充分发挥。

纳米技术与药学相结合，衍生出了纳米药物，即药物与辅料制成的粒径为1～1000 nm的载药粒子（如纳米粒、纳米脂质体、纳米乳）或纳米药物晶体/微粉（drug nanocrystals）[5]。前者属基质骨架型或囊泡型纳米药物制剂，制备工艺复杂，载药量较低。后者，仅需加入少量的稳定剂，借助强大的机械能形成高度分散的药物纳米结晶系统，含药量可接近100%。作为一种制剂中间体，纳米药物晶体/微粉可进一步制成适于口服、注射或其他给药途径的制剂。纳米药物晶体/微粉可解决多数难溶性药物的溶解度问题，提高其口服生物利用度，改善体内分布等[6]。

鉴于此，本课题组前期已采用机械粉碎法，对ABZ原料进行纳米化加工，加入少量的分散剂，成功制备了粒径在270～290 nm范围的ABZ纳米微粉。然而，ABZ纳米微粉是否具有相对于ABZ原料在改善吸收方面的优势，亟待验证。药物的理化参数与其在生物体内膜渗透性具有很大相关性，有助于预测药物动力学性质。平衡溶解度和表观脂水分配系数作为药物理化参数的两个不可或缺方面对于预测药物在体内过程有很大帮助[7-9]。因此本课题组在前期已对ABZ原料的平衡溶解度和表观脂水分配系数进行了测定[10]，而本文则研究了ABZ纳米微粉在不同极性溶剂和不同pH缓冲液中的平衡溶解度，以及在正辛醇-水和正辛醇-盐酸/磷酸盐缓冲液中的表观分配系数，通过与ABZ原料进行对比，以期为研制可以改善ABZ生物利用度和药效的新剂型以及新剂型的体内外评价打下基础。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Waters 2695 HPLC色谱仪；KQ-200VDB型双频数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；BP211D电子天平（德国Sartorius公司）；FE20精密pH计（梅特勒-托利多上海有限公司）；FJY 1002-UVF基因研究型超纯水机（青岛富勒姆科技有限公司）；HC-3018R高速冷冻离心机（安徽中科中佳化学仪器有限公司）；IKA MS3数显型涡旋振荡器（德国IKA公司），ZEN3690激光粒度分布仪（英国马尔文公司）。

1.2 试药

ABZ对照品（美国Sigma公司，纯度>99.8%，批号：081M1540V）；ABZ原料（廣西桂林南药股份有限公司，M-090605，纯度>98%），ABZ纳米微粉（自制，批号：20140619）；磷酸二氢钾（天津市福晨化学试剂厂，批号：20130501）；磷酸氢二钾（天津市福晨化学试剂厂，批号：20101012）；磷酸氢二钠（天津市福晨化学试剂厂，批号：20101012）；氢氧化钠（天津市福晨化学试剂厂，批号：20090207）；三乙胺（天津市福晨化学试剂厂，批号：2030328）；甲醇（美国Fisher试剂公司，色谱纯）；乙腈（美国Fisher试剂公司，色谱纯）；微孔滤膜（0.22 μm）水相/有机相（成都市艾莱特科技有限公司）；乙酸乙酯（天津市光复精细化工研究所，批号：20130709）；甲酸（天津市致远化学试剂有限公司，批号：20120728）；甲醇（天津化学试剂厂，批号：20130115 ）；无水乙醇（天津化学试剂厂，批号：20130115）；异丙醇（天津市北辰骅跃化学试剂厂，批号：20010718）；正丁醇（天津市富宇精细化工有限公司，批号：20001017）；正辛醇（天津市福晨化学试剂厂，批号：20110715）；丙酮（天津化学试剂厂，批号：20010428）；氯仿（天津市福晨化学试剂厂，批号：20121012）；水为重蒸馏水。

2 方法与结果

2.1 ABZ原料及ABZ纳米微粉粒径及粒径分布的测定

取ABZ原料及ABZ纳米微粉适量，加蒸馏水稀释，混匀后用ZEN3690激光粒度分布仪测定两者的粒径及分布（图1）。ABZ原料平均粒径（1752±11.5）nm，PDI值为0.92±0.04，纳米微粉平均粒径为（275±1.5）nm，PDI值为0.17±0.01。

2.2 溶液的制备[10]

2.2.1 对照品溶液 精密称取ABZ对照品10 mg置于5 mL量瓶中，加入500 μL冰醋酸将其溶解，用甲醇稀释至刻度，得2 mg/mL贮备液。

2.2.2 不同介质溶液 按《中国药典》2015年版[11]配制pH为1.2的盐酸溶液和pH为2.0、2.5、5.0、5.8、6.5、6.8、7.0、7.4、7.8系列的磷酸盐缓冲液（PBS）。

2.3 色谱条件[10]

色谱柱：XTerraRp18色谱柱（150 mm×3.9 mm，5 μm）；流动相：甲醇-乙腈-pH3.0三乙胺磷酸缓冲液（24∶20∶56）；流速：1.0 mL/min；检测波长：295 nm；柱温：30℃；进样量：20 μL。在上述色谱条件下，ABZ在水、不同有机溶剂和不同pH缓冲液中的保留时间均约为5.5 min，理论板数按ABZ峰计算均不低于9000，与相邻杂质峰的分离度和对称因子均符合《中国药典》的相关要求。溶解于甲醇中的ABZ对照品和溶解于水和甲醇中供试品及不含ABZ的阴性样品色谱图见图2，溶解于其他不同有机溶剂和不同pH缓冲液中的ABZ对照品和供试品及阴性样品色谱图均与图2相同，表明该检测方法的专属性符合《中国药典》的相关要求。

2.4 方法学考察[5]

2.4.1 线性关系考察 精密量取ABZ储备液，用甲醇稀释，分别配制0.1、0.5、1、2、8、64、120、250 μg/mL的对照品系列溶液。按“2.3”项下色谱条件进行分析测定，记录峰面积，以ABZ质量浓度（x）为横坐标、峰面积（y）为纵坐标，进行回归分析，得回归方程为：y=51 988x-3052（r=0.9998）。结果表明，ABZ质量浓度在0.1～250 μg/mL范围内与峰面积呈良好的线性关系。

2.4.2 精密度试验 结果显示，高、中、低浓度（250、8、0.1 μg/mL）的ABZ对照品溶液日内RSD分别为0.37%、0.62%、0.19%（n=6），日间RSD分别为0.82%、1.03%、1.04%（n=6）。结果表明，该检测方法日内和日间精密度良好，符合《中国药典》的相关规定。

2.4.3 回收率试验 结果显示，高、中、低浓度（250、8、0.1 μg/mL）的ABZ对照品溶液回收率分别为98.82%、100.1%、101.3%（n=3），RSD分别为0.67%、1.14%、1.02%（n=3）。结果表明，该检测方法准确度高，符合《中国药典》的相关规定。

2.4.4 稳定性试验 ABZ纳米微粉分别在水、不同有机溶剂（甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮、正丁醇、乙酸乙酯、氯仿）、不同pH（pH=1.2的盐酸溶液及pH=2.0、2.5、5.0、5.8、6.5、6.8、7.0、7.4、7.8的PBS）中被制成供试品溶液，在室温下放置，于24 h内不同时间点取样，结果显示，其峰面积的RSD均<2%（n=6），表明供试品溶液在室温下24 h内稳定，满足本研究供试品测定所需的放置时间。

2.5 平衡溶解度的测定[10]

取20 mL不同溶剂，置于100 mL锥形瓶中，加入过量ABZ纳米微粉，超声（200 W，44 kHz）至药物不再溶解为止；密封后放入空气恒温振荡器中，温度保持在（37±1）℃，进行振摇，24 h后取样（经预试验确定振摇24 h溶解即可达到平衡），于10 000 r/min离心15 min，吸取上层的饱和清液，过0.22 μm微孔滤膜，取续滤液3 mL，加入冰醋酸0.5 mL，按“2.3”项下色谱条件进样20 μL，超出线性范围的样品用甲醇稀释一定的倍数，保证样品浓度在线性范围以内，记录峰面积。按外标法以峰面积计算ABZ在各个介质中的平衡溶解度。

2.5.1 不同极性溶剂 ABZ纳米微粉分别在蒸馏水、甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮、正丁醇、乙酸乙酯、氯仿中的平衡溶解度及与文献[10]对比结果见表1。研究结果表明，ABZ纳米微粉的溶解度从大到小排序溶剂依次为甲醇、丙酮、乙醇、正丁醇、氯仿、乙酸乙酯、异丙醇、水；ABZ纳米微粉在丙酮、异丙醇、乙醇、甲醇、水中较ABZ原料溶解度均有所增加，从大到小排序溶剂依次为水、甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮，但在正丁醇、乙酸乙酯和氯仿中却有所下降。

2.5.2 不同pH溶剂 ABZ纳米微粉分别在pH=1.0盐酸溶液，pH=2.0、2.5、5.0、5.8、6.5、6.8、7.0、7.4、7.8 PBS中的平衡溶解度及與文献[10]对比结果见表2。研究结果表明，ABZ作为水难溶性弱酸和弱碱两性化合物，在pH=1.2～6.8偏酸性缓冲液中，阿苯达唑纳米微粉溶解度依次下降，但较ABZ原料溶解度增大率却依次大幅度上升；在pH=7.0～7.8偏碱性缓冲液中，溶解度依次略微上升，较ABZ原料溶解度增大率仍旧保持大幅度上升。

2.6 表观脂水分配系数的测定[12]

称取ABZ纳米微粉适量，溶于水溶液，pH=1.2盐酸缓冲液，pH=2.0、5.0、5.8、6.4、7.0、7.8的PBS饱和的正辛醇中，取该样品溶液5 mL置于具塞锥形瓶中，再分别加入正辛醇饱和水溶液，pH=1.2盐酸缓冲液，pH=2.0、5.0、5.8、6.4、7.0、7.8的PBS各50 mL，放入空气振荡器中，温度保持（37±1）℃振摇24 h，10 000 r/min离心15 min，分别取上、下层（油、水相），过0.22 μm微孔滤膜，取续滤液各3 mL，加入冰醋酸0.5 mL，按“按2.3”项下色谱条件进样20 μL，超出线性范围的样品用甲醇稀释一定的倍数，保证样品浓度在线性范围以内，记录峰面积。由外标法计算油相及水相中ABZ的质量浓度，分别记做CO、CW；按公式计算表观脂水分配系数：Papp=CO/CW，lgP=lg CO/CW。其中，CO为药物分配平衡时，ABZ在正辛醇中的浓度，CW为ABZ在水溶液，pH=1.2盐酸缓冲液，pH=2.0、5.0、5.8、6.4、7.0、7.8的PBS中的浓度。测定结果及与文献[10]对比结果见表3。考察ABZ纳米微粉在水和不同pH缓冲体系中的lgP值变化趋势，结果表明，无论是在正辛醇层，还是在水层或不同pH缓冲液中，ABZ纳米微粉的ABZ质量浓度均大于ABZ原料的质量浓度，同时ABZ纳米微粉的lgP值与ABZ原料相比略有下降。

3 讨论

3.1 平衡溶解度

平衡溶解度是反映药物溶解性的重要指标。对于可溶性药物，粒子大小对溶解度影响不大，但对于难溶性药物，当粒径<1 μm时，溶解度与药物粒子粒径有关[13]。当药物粒径在纳米尺度范围内，由于粒子的表面能与体积比显著增加，药物的溶解度会随着粒径减小而增大[14-15]。在奥斯特瓦尔德-弗罗因德利希方程式中，也描述了溶解度对粒径的依赖性[16-17]。根据奥斯特瓦尔德-弗罗因德利希方程（①），公式中r和Cs成反比，当粒径<1 μm时，粒径越小，Cs越大。

ABZ原料在水中的溶解性很差[在水中的平衡溶解度仅为（0.26±0.02）μg/mL）]，经过纳米化加工的ABZ纳米微粉在水中的溶解性有所提高[在水中的平衡溶解度为（125.25±1.45）μg/mL]，提高了481倍；此外，本研究溶剂的极性从强到弱依次为水、甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮、正丁醇、乙酸乙酯、氯仿。ABZ原料的溶解度大小与溶剂极性呈负相关，而ABZ纳米微粉溶解度与溶剂极性相关性不大，但ABZ纳米微粉的溶解度增大率却与溶剂极性相关，极性越大，增大率越高；但随着极性的减弱，以正丁醇为界限，ABZ纳米微粉在正丁醇、乙酸乙酯和氯仿中溶解度较ABZ原料均有不同程度的降低。ABZ纳米微粉在本研究中增加表观溶解度的原因除了与ABZ粒径减小有关外，还可能与在微粉中添加分散剂组分从而降低ABZ界面张力有关，但其对不同溶剂中溶解度改变的规律和机制还需进一步研究。

3.2 表观脂水分配系数

分配系数是指药物在两个不相混溶的溶剂中溶解并达到平衡时浓度的比值。药物在体内的溶解、吸收、分布、转运与药物的水溶性和脂溶性有关，也即与脂水分配系数有关[18]。药物需要有适当的脂水分配系数，一般认为lgP过低（lgP< -2），药物不能穿过脂质膜；lgP过高（lgP>5），药物因脂溶性过强而很难从细胞另一侧的膜释放出来，进入附近的血管或淋巴管[19]。药物的最佳lgP值应在0～3之间[20]。本研究结果ABZ纳米微粉在pH=1.2～2.0环境下lgP值最佳（lgP为0～2），在蒸馏水和pH=5.0～7.8偏酸性、中性和偏碱性环境中lgP有较大值（lgP为3～4），说明纳米ABZ微粉偏脂溶性，适于制成口服制剂，可以被胃肠道吸收，但最佳吸收部位应该是胃（pH=0～2）[21-22]。

本研究表观脂水分配系数测定结果表明，无论是在正辛醇层，还是在水层或不同pH缓冲液中，ABZ纳米微粉的ABZ质量浓度均大于ABZ原料的质量浓度，其原因同样可能与ABZ粒径减小及微粉中添加分散剂组分降低ABZ界面张力有关，说明ABZ纳米微粉的胃肠道吸收量大于ABZ原料。另外，通过对在不同pH缓冲液条件下平衡溶解度的测定，在lgP值最佳的pH=1.2～2.0环境下，ABZ纳米微粉增大了ABZ原料的平衡溶解度；特别是lgP值有较大值的pH=5.0～7.8偏酸性、中性和偏碱性环境下，ABZ纳米微粉均显著增大了ABZ原料的平衡溶解度，故可以预测纳米微粉通过溶解更多药物的途径不但可以提高ABZ原料在最佳lgP值胃中的吸收，而且还可以改善lgP为3～4的肠道（pH=4～8）中的吸收。但ABZ纳米微粉是否能在体内达到增加ABZ原料的生物利用度的效果，还需要体内药动学的进一步研究。

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（收稿日期：2016-07-30 本文编辑：王红双）