RECK与MMP—9在人骨肉瘤组织中的表达及相关性分析

付文娟　董桂兰　孙芳初　王连立　郭静

[摘要] 目的 探讨伴有kazal域的富含半胱氨酸的逆转诱导蛋白（RECK）与基质金属蛋白酶9（MMP-9）在人骨肉瘤组织中的表达及相关性。 方法 选取唐山市人民医院2001年1月～2010年12月临床及病理资料完整存档的人骨肉瘤组织标本34例为观察组，另取临床及病理资料完整存档的骨软骨瘤组织标本34例为对照组，采用免疫组织化学法检测RECK和MMP-9，采用定量PCR法检测RECK和MMP-9的mRNA，并分析指标相关性。 结果 观察组RECK阳性率（58.8%）低于对照组（91.2%），而MMP-9阳性率（64.7%）高于对照组（11.8%），差异有统计学意义（P < 0.05）。RECK阳性率、RECK的mRNA表达、MMP-9阳性率、MMP-9的mRNA表达在年龄、性别、病发部位方面比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。RECK阳性率、RECK的mRNA表达、MMP-9阳性率、MMP-9的mRNA表达在转移、复发以及生存时间方面比较，差异有统计学意义（P < 0.05）。RECK与人骨肉瘤组织呈明显负相关（r=-0.561，P=0.000）。MMP-9与人骨肉瘤组织呈明显正相关（r=0.613，P=0.000）。 结论 RECK可抑制MMP-9表达，发挥抑癌作用，有望成为未来诊断以及治疗人骨肉瘤的潜在靶標。

[关键词] 伴有kazal域的富含半胱氨酸的逆转诱导蛋白；基质金属蛋白酶9；人骨肉瘤；相关性

[中图分类号] R73-3 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2016）11（c）-0016-05

Expression and correlation analysis of RECK and MMP-9 in human osteosarcoma tissues

FU Wenjuan1 DONG Guilan1 SUN Fangchu1 WANG Lianli1 GUO Jing2

1.The Fifth Department of Radiotherapy and Chemotherapy， People's Hospital of Tangshan City， Hebei Province， Tangshan 063000， China；2.Medical Experimental Research Center， North China University of Science and Technology， Hebei Province， Tangshan 063000，China

[Abstract] Objective To explore the expression and correlation analysis of RECK and MMP-9 in human osteosarcoma tissues. Methods 34 cases of human osteosarcoma tissues which had complete clinical and pathological data were selected in Tangshan People's Hospital from January 2001 to December 2010 as observation group. 34 cases of osteochondroma tissues which had complete clinical and pathological data were selected as control group. Immunohistochemical method was used to detect RECK and MMP-9. Quantitative PCR method was used to detect mRNA of RECK and MMP-9. Correlation of indexes were analyzed. Results Positive rate of RECK in observation group （58.8%） was lower than that of control group （91.2%）， positive rate of MMP-9 in observation group （64.7%） was higher than that of control group （11.8%）， with statistical difference （P < 0.05）. As RECK positive rate， mRNA expression of RECK， MMP-9 positive rate， mRNA expression of MMP-9 compared in gender， age， disease location， differences were not statistically significant （P > 0.05）. As RECK positive rate， mRNA expression of RECK， MMP-9 positive rate， mRNA expression of MMP-9 compared in survival time， recurrence， metastasis， differences were statistically significant （P < 0.05）. RECK was negatively correlated with human osteosarcoma tissues （r=-0.561， P=0.000）. MMP-9 was positively correlated with human osteosarcoma tissues （r=0.613， P=0.000）. Conclusion RECK can inhibit the expression of MMP-9， and play a role in inhibiting cancer， which can be expected to potential target for future diagnosis and treatment in human osteosarcoma.

[Key words] RECK； MMP-9； Human osteosarcoma； Correlation

人骨肉瘤是青少年儿童时期最为常见的一种恶性肿瘤[1-2]，尽管随着医学科技的不断进步，切除手术与辅助化疗法能够达到一定治疗效果，但肿瘤的转移与侵袭对治愈率的影响不容忽视。据统计，患者5年内无瘤存活率仅为65%[3]。因此，对于肿瘤侵袭以及转移机制的研究不仅能够提高对发病机制的认识，同时有效利用阻碍肿瘤转移屏障，对提高治疗效果及预后有一定临床意义。有研究显示，伴有kazal域的富含半胱氨酸的逆转诱导蛋白（RECK）具有干扰肿瘤基因表达，发挥抑制肿瘤转移作用[4-5]。目前有关人骨肉瘤组织中RECK的表达与人骨肉瘤临床病理特征及肿瘤转移侵袭的报道较少。基质金属蛋白酶9（MMP-9）基因位于染色体20q11.1～13.1，26～27kbp，具有13个外显子和9个内含子，属于基质金属蛋白酶家族，其主要功能是降解和重塑细胞外基质的动态平衡。MMP-9在人骨肉瘤组织中发挥了何种作用，也是此次研究的关键性问题。因而开展此次研究，对人骨肉瘤组织中RECK和MMP-9进行检查，同时对RECK、MMP-9与人骨肉瘤临床病理表現及转移、侵袭的关系进行探讨。具体报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择唐山市人民医院（以下简称“我院”）2001年1月～2010年12月临床及病理资料完整存档的人骨肉瘤组织标本34例为观察组，入选标准：①肢体恶性人骨肉瘤；②首发患者；③接受根治性或广泛性切除术；④接受辅助化疗。所有肿瘤样本的检验均由我院病理科的两位以上副高医师进行确诊后进行。男20例，女14例，年龄5～51岁，平均（21.6±4.6）岁。本研究所有程序均经我院医学伦理委员会审核、批准。

另取临床及病理资料完整存档的骨软骨瘤组织标本34例为对照组，入选标准：①经病理检查确诊为骨软骨瘤；②首发患者；③接受根治性切除术。所有肿瘤样本的检验均由我院病理科的两位以上副高医师进行确诊后进行。男21例，女13例，年龄6～53岁，平均（21.8±5.3）岁。本研究所有程序均经我院医学伦理委员会审核、批准。

1.2 方法

1.2.1 仪器与试剂 恒温培养箱购自北京市永光明医疗仪器有限公司；Thermo热电FC酶标仪购自北京伯辉生物科技有限公司；iChem-340全自动生化分析仪购自深圳市库贝尔生物科技股份有限公司；Allegra 64R台式高速冷冻离心机购自美国贝克曼库尔特有限公司；AM5000实时荧光定量PCR检测系统购自上海吉泰生物科技有限公司。

SP染色试剂盒购自上海瑞齐生物科技有限公司；兔抗人多克隆抗体购自通派（上海）生物科技有限公司；二氨基联苯胺/DAB染色试剂盒购自南京化学试剂有限公司；多聚赖氨酸购自美国Sigma公司。

1.2.2 免疫组织化学 采用标准方法制作人骨肉瘤组织石蜡切片[6]，即福尔马林固定和石蜡包埋，具体如下：对切片进行脱蜡水化，用pH=6的枸橼酸钠进行修复2 min，用浓度为30 mL/L的双氧水进行常温封闭10 min，目的是破坏过氧化物酶的生物活性。然后用PBS缓冲液进行洗涤，重复3次，加入浓度为50 mL/L的胚胎牛血清常温封闭20 min，控制室温为37℃，依次用一抗、二抗孵育2 h和30 min，每次孵育后都要进行3次PBS缓冲液洗涤，用辣根过氧化酶标记生物素染色，用二氨基联苯胺液显色，并用苏木精复染，而后脱水，透明，封片。在显微镜下观察并记录结果。判定标准要根据细胞染色强度和显色比例进行判定，具体如下[7]：阳性细胞数目>80%计为4分，阳性细胞数目在51%～80%之间计为3分，阳性细胞数目在11%～50%之间计为2分，染色强计为3分，染色中等计为2分，染色弱计为1分。阳性细胞数目不足10%认定为阴性（-）。评分3～5分为弱阳性（+），评分6～7分为强阳性（++）。采用相同方法制作骨软骨瘤组织标本，并行RECK检查。同样方法检测MMP-9，于肿瘤侵袭边缘和肿瘤内染色相对密集区选取4个视野，阴性（-）：无明显阳性细胞；弱阳性（+）：阳性细胞率<25%；阳性（++）：阳性细胞率为25%～75%；强阳性（+++）：阳性细胞率>75%。

1.2.3 实时荧光定量PCR检测

提取人骨肉瘤组织总RNA时，可采用Trizol试剂，将提取出来的RNA置于20 μL反应体系中，待其逆转录为cDNA。应用AM5000实时荧光定量PCR检测系统进行测定，严格按照操作规程进行，每个样本都要进行3次重复测量，然后取平均值。设定条件如下：在95℃下设定反应时间为5 s，在60℃下设定反应时间为30 s，实施40个循环。循环阈值要以仪器荧光预设点为限[8]。同法检测MMP-9。

1.3 统计学分析

采用SPSS 19.0统计软件对数据进行分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，采用t检验，计数资料用百分率（%）表示，采用χ2检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患者人骨肉瘤组织中RECK的表达情况

由于RECK存在于细胞质，检测结果中组织细胞的细胞质为棕黄色，且分布模式多为弥漫性分布，少见点状或灶状分布。见图1（封三）。观察组RECK阳性结果为20例，阳性率为58.8%；对照组RECK阳性结果为31例，阳性率为91.2%。两组患者RECK阳性率比较，差异有统计学意义（χ2=9.490，P=0.002）。

2.2 RECK与人骨肉瘤的临床病理特征分析

RECK阳性率在年龄、性别、病发部位方面比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。RECK阳性率在转移、复发以及生存时间方面比较，差异有统计学意义（P < 0.05）。

2.3 RECK的mRNA表达与人骨肉瘤组织的临床病理特征分析

RECK的mRNA表达在年龄、性别、病发部位方面比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。RECK的mRNA表达在转移、复发以及生存时间方面比较，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表2。

2.4 两组患者人骨肉瘤组织中MMP-9的表达情况

观察组MMP-9阳性结果为22例，阳性率为64.7%；对照组MMP-9阳性结果为4例，阳性率为11.8%。两组MMP-9阳性率比较，差异有统计学意义（χ2=20.176，P=0.000）。两组患者人骨肉瘤组织中MMP-9的表达情况见图2（封三）。

2.5 MMP-9与人骨肉瘤的临床病理特征分析

MMP-9阳性率在年龄、性别、病发部位方面比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。MMP-9阳性率在转移、复发以及生存时间方面比较，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表3。

2.6 MMP-9的mRNA表达与人骨肉瘤组织的临床病理特征分析

MMP-9的mRNA表达在年龄、性别、病发部位方面比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。MMP-9的mRNA表达在转移、复发以及生存时间方面比较，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表4。

2.7 RECK、MMP-9与人骨肉瘤组织相关性分析

经相关性分析，RECK与人骨肉瘤组织呈明显负相关（r=-0.561，P=0.000）；MMP-9与人骨肉瘤组织呈明显正相关（r=0.613，P=0.000）。

3 讨论

人骨肉瘤通常发病于患者间叶组织，进而生成梭形的骨样组织基质细胞。该类肿瘤发病迅速、恶性程度、致残率及死亡率极高，且预后较差[9-10]。在肿瘤的发生、发展过程中基质金属蛋白酶类家族发挥着重要作用，它不仅能够对肿瘤组织的血管生成有一定促进作用，同时在血小板-癌细胞聚集、癌旁组织血纤维蛋白的消化、癌细胞的黏附等方面均起调控作用[11]。此外，基质金属蛋白酶对肿瘤组织基底膜细胞具有极强的降解作用，因此调节肿瘤组织中基质金属蛋白酶水平对于抑制肿瘤的转移及复发是目前临床上有关肿瘤治疗的研究热点[12]。

据报道，RECK定位于染色體9P12-P13上，属于基质金属蛋白酶抑制剂，由971个氨基酸构成的蛋白质编码形成，结构中羧基端的糖蛋白I和氨基端的半胱氨酸重复构造有助于促使该基因稳定结合于细胞膜之上[13-14]。目前已知，RECK广泛存在于人体皮肤、胃肠道、血管内皮细胞等处，并参与了机体多种生理活动，包括细胞分化、细胞周期、细胞凋亡等。但RECK与人骨肉瘤的关系至今尚无明确解释。有研究显示，RECK可通过抑制基质金属蛋白酶分泌发挥抑制肿瘤侵袭及转移的作用，且该基因通常在正常组织中表达较高，在肿瘤组织中表现为弱表达甚至失表达[15]。

本研究采用免疫组织化学法、定量PCR法对不同临床病理特征患者人骨肉瘤组织中RECK的表达进行研究，发现观察组RECK阳性率（58.8%）低于对照组（91.2%），而MMP-9阳性率（64.7%）高于对照组（11. 8%）。说明34例人骨肉瘤患者组织中RECK呈降低态势，而MMP-9有升高态势。比较不同临床病理特征患者人骨肉瘤患者组织中RECK的阳性细胞率发现，年龄、性别以及发病部位不同的患者人骨肉瘤患者组织中RECK的阳性细胞率差异不显著。而对患者进行随访后发现，出现肿瘤转移、肿瘤复发以及60个月内死亡的患者人骨肉瘤患者组织中RECK的阳性细胞率明显低于未出现肿瘤转移、肿瘤复发、生存时间≥60个月的患者，差异有统计学意义。说明RECK基因表达的下调可能伴随着肿瘤的生长，RECK的阳性细胞率低的患者更易出现肿瘤转移、复发。

定量PCR结果显示，不同年龄、性别以及发病部位的患者，人骨肉瘤组织中mRNA的表达差异无统计学意义（P > 0.05）。但肿瘤转移、复发以及生存时间短的患者人骨肉瘤组织中mRNA的表达较低，不同类型患者人骨肉瘤组织中mRNA的表达差异存在统计学意义（P < 0.05）。据报道，肿瘤组织中的RECK的表达水平与MMP-2表达水平存在负相关性，即RECK的高表达能够有效抑制MMP-2的表达水平，进而发挥肿瘤转移抑制作用[16-17]。此外，有学者报道，RECK通过降低MMP-9和MT1-MMP酶活性发挥抑制肿瘤转移效果。转染恢复RECK表达的HT1080细胞中，以上三种基因蛋白表达水平得到下调，肿瘤侵袭及转移过程中所需的蛋白水解酶含量下降，进而抑制肿瘤的发展[18-19]。对比单纯接种HT1080细胞及接种转染RECK后的HT1080细胞的裸鼠发现，经过转染的裸鼠组体内肿瘤细胞死亡，且病理切片结果显示，肿瘤组织的微血管密度降低，新生血管数量减少[20]。

综上所述，RECK与人骨肉瘤的关系是非常密切的。RECK因子可能为一种抑癌因子，抑制肿瘤细胞的侵袭和迁移，有望成为人骨肉瘤未来诊断以及治疗的潜在靶标。MMP-9也参与其中。但此次研究也存在一定弊端，样本量较少，仍需要进一步扩大再研究。

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（收稿日期：2016-08-06 本文編辑：王红双）