替加环素对鲍曼不动杆菌生物膜影响的研究

吕月贤，金玉芬，于 庭

(吉林大学第二医院，吉林 长春130041)

*通讯作者

替加环素对鲍曼不动杆菌生物膜影响的研究

吕月贤，金玉芬，于 庭*

(吉林大学第二医院，吉林 长春130041)

细菌生物膜(bacterial biofilm,BF)是细菌在生长过程中为适应生存环境而吸附于惰性或活性材料表面形成的一种与浮游细胞(planktoniccell)相对应的生长方式，当细菌受到各种压力时,如极端的营养缺乏或过剩、抗生素和抗菌剂、氧化、低 pH值等,大量细菌为了对抗不利的环境,通过自身合成的水合多聚物粘附在固体表面,并在胞外聚合物中生长繁殖而形成的细菌群落[1，2]。 多重耐药鲍曼不动杆菌(Multiple drug resistant Acinetobacter Bauman,MDR-Ab)是一种条件致病菌，普遍存在于自然界和人体，是医院感染最常见的机会致病菌之一，近年来在临床分离的致病菌中鲍曼不动杆菌逐年增多。目前临床上对鲍曼不动杆菌耐药性关注逐年增加,除了高水平的抗菌素耐药性， 最近的一些研究表明，某些MDR鲍曼不动杆菌菌株可形成大量生物膜，且这种细菌一旦形成生物膜,就难以清除,导致严重的临床问题以及宿主免疫系统缺失[3-5]。本实验主要研究亚抑菌浓度替加环素对MDR-Ab菌生物膜的破坏作用，从而为耐药菌引起的感染性疾病提供了临床治疗的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药品与试剂 替加环素,批号:#B1527011,购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；结晶紫，批号：20141202，购自国药集团化学试剂有限公司； 0.9%生理盐水，批号：H13023200,购自石家庄四药有限公司；胰蛋白胨大豆肉汤(TSB),批号：1361046，购自北京拜尔迪生物技术有限公司。

1.1.2 仪器 24孔和96孔细胞培养板，上海阿拉丁生物科技有限公司；细菌生物膜载体(直径14 mm细胞爬片)，上海阿拉丁生物科技有限公司；多功能酶标仪,Termo Scientific； 电热恒温培养箱，上海跃进医疗器械厂；共聚焦倒置显微镜，OLYMPUS。

1.1.3 菌株 收集自吉林大学第二医院2015年4-12月份临床微生物室送检的80份标本(其中同一患者感染部位的相同菌株剔除掉),经法国梅里埃VIKET2全自动微生物分析仪进行菌种鉴定和药敏检测鉴定为MDR-Ab菌。

1.2 方法

1.2.1 药敏试验 联合采用VIKET2全自动微生物分析仪和纸片扩散法对菌株进行药敏鉴定，结果按美国临床实验室标准化研究所(CLSI)抗菌药物敏感性实验指南判别，鲍曼不动杆菌对头孢菌素类(如头孢他啶或头孢吡肟)、碳青霉烯类(如亚胺培南)、β-内酰胺酶抑制剂(如头孢哌酮/舒巴坦)、氟喹诺酮类(如环丙沙星)和氨基糖苷类(如阿米卡星)中的3类或3类以上抗菌药物耐药即判别为MDR-Ab菌。

1.2.2 目标菌的复苏 将保存在EP管中的目标菌于-20℃冰箱中取出，加入1 ml TSB肉汤培养基，振荡混匀，将目标菌接种至血平板和麦康凯培养皿中，于35±2℃恒温培养箱中培养24 h。

1.2.3 测定替加环素的最低抑菌浓度(MIC) 采用微量肉汤稀释法测定替加环素对MDR-Ab菌株的MIC 将复苏后传第一代的目标菌稀释至106CFU/mL,于96孔板15个孔中均加入100 μl MH肉汤,第一个孔中加入100 μl 1024 μg/mL替加环素，参照美国 2012CLSI所制定的标准进行微量肉汤稀释法倍比稀释，再在每孔中加入100 μl上述稀释浓度的目标菌稀释液,每株菌设置6个复孔，并设置空白对照组 (MH肉汤培养基 100 μl)作为对照。置于培养箱中培养 20 h,记录实验结果,以在小孔内完全抑制细菌生长的最低浓度为 MIC。

1.2.4 结晶紫半定量法测定目标菌株生物膜形成水平 目标菌株生物膜的制备 挑取单个菌落的目标菌4-5个接种至TSB肉汤中，35±2℃恒温培养箱中培养6 h取出，调整菌液浓度为5×105CFU/mL.无菌 24孔板中加入上述浓度的菌液 600 μl，每株菌3个复孔，并设置阴性对照孔,35±2℃ 恒温培养箱中培养，隔天换液,3 d后在玻片表面形成成熟生物膜。

结晶紫半定量染色法测定生物膜 玻片经0.9% NaCl 漂洗，用 0.1%的结晶紫染色20 min后，用自来水冲洗去除多余的染液，再加入400 μl 95%乙醇洗脱下生物膜上的结晶紫，最后从洗脱液中取出 200 μl至96孔板中，于多功能酶标仪570 nm 波长处测定每株细菌染色后的OD值,每株菌所测OD值得均值为A，阴性对照组所测OD值均值为Ac，比较样本A与Ac。根据OD值，将菌株生物膜形成能力分为4类：A≤Ac为阴性(-)；Ac4Ac为强阳性(+++)。

1.2.5 替加环素对目标菌生物膜的影响 替加环素破坏成熟生物膜 将0 mg/L(阴性对照组),0.5 mg/L,1 mg/L,2 mg/L四个不同浓度的替加环素作用于已形成成熟生物膜的鲍曼不动杆菌分为a,b，c，d四组，按照1.2.4所述，先于24孔板中形成成熟的生物膜，再在已成膜的孔中加入上述不同浓度的替加环素,35±2℃恒温培养箱中分别培养48 h、96 h后，分别取出,酶标仪半定量测定生物膜OD值,并记录数据。

1.2.6 生物膜形态的观察 观察不同亚抑菌浓度的替加环素对已经形成成熟生物膜破坏情况 按上述所述方法在24孔板中形成成熟的生物膜,再在有膜的孔中分别加入600 μl上述不同亚抑菌浓度的替加环素,35±2℃恒温培养箱中分别培养48 h、96 h后，分别取出，共聚焦倒置光学显微镜下观察鲍曼不动杆菌的破膜情况。

1.2.7 数据处理 用SPSS 19.0统计软件分析数据,采用单因素的方差分析，分析四组不同条件下所测OD值之间是否具有显著性差异，P<0.05有统计学意义。

2 结果

2.1 细菌耐药表型测定结果

80株鲍曼不动杆菌均为多重耐药菌,其中有18株菌对复方新诺明、左氧氟沙星敏感,9株菌仅对复方新诺明敏感，其余对5类抗菌药物全耐药。

2.2 MIC测定值

替加环素对80株鲍曼不动杆菌的MIC的检测数据的范围为0.5-4.0 mg/L，对多次测量所得的MIC测量值取平均值为2 mg/L。

2.3 生物膜半定量测定结果

80株菌中78株有形成生物膜能力(97.5%)，生物膜形成能力弱阳性的菌株有8株(10%)，阳性菌株48株(60%),强阳性的菌株22株(27.5%),见表1。

2.4 替加环素对成熟生物膜的影响

a,b，c，d 4组不同条件下作用于鲍曼不动杆菌生物膜48 h和96 h所测OD值，见表2,3。统计学显示，各组之间两两进行比较,结果显示无论作用48 h还是96 h,b,c,d与a组之间比较均有显著性差异(P48 h分别为0.000,0.000,0.006,P96 h均为0.000)，表明亚抑菌浓度下的替加环素具有破坏成熟生物膜的能力，而在b，c，d三组之间进行比较时发现c,d两组之间没有显著性差异(P48 h=0.094,P96 h=0.063)，b,c之间存在差异(P48 h=0.422,P96 h=0.378)，b,d之间存在显著性差异(P48 h=0.001,P96 h=0.000)。即2 mg/L和1mg/L浓度的替加环素破坏生物膜的能力没有差异，但均与0.5 mg/L浓度的替加环素破坏生物膜的能力有差异,且比其破坏能力强,统计结果见表4。

2.5 生物膜形态学观察

用0.1%结晶紫染色，在共聚焦倒置显微镜下观察不同亚抑菌浓度的替加环素对所形成的成熟的生物膜的破坏情况。结果显示，总体趋势为成膜细菌密度随着替加环素浓度升高而降低，2 mg/L的替加环素所形成的细菌生物膜非常稀薄，细菌散在存在，而阴性对照组中所形成的细菌生物膜比较浓密，如图1所示。

表2 亚抑菌浓度替加环素作用于成熟生物膜48 h的影响(OD值,±s)

表3 亚抑菌浓度替加环素作用于成熟生物膜48 h的 影响(OD值,

表4 单因素方差分析4组数据两两比较

注：均值差的显著性水平为 0.05。

注：a、b、c、d依次为阴性对照、2 mg/L、1 mg/L、0.5 mg/L替加环素作用于成熟生物膜

图1 替加环素对鲍曼不动杆菌成熟生物膜的影响

3 讨论

实验室的研究结果显示，生物膜细菌对抗生素和杀菌消毒剂的抵抗力比浮游的非生物膜细菌强100-1000倍，因此细菌耐药问题是目前人类面临的最大生存危机[6]。 研究发现,小剂量十四、十五环大环内酯类药物如红霉素、克拉霉素、罗红霉素、阿奇霉素等，还有磷霉素均可破坏鲍曼不动杆菌生物膜结构，敏感抗生素和小剂量大环内酯类药物联用对于破坏鲍曼不动杆菌生物膜的结果效更理想[7]。乙醇、氯化钠和大豆油、氯化十六烷吡啶结合，能破坏鲍曼不动杆菌生物膜。一些物理方法如电流、高频脉冲、超声震荡法可以破坏成熟的鲍曼不动杆菌生物膜来提高抗生素对细菌的敏感性[8]。但目前国内对于替加环素作用于生物膜的研究较少。

鲍曼不动杆菌引起的院内获得性感染已成为患者高发病率和高病死率的主要原因之一，尤其是ICU和免疫力低下的患者[9]。目前鲍曼不动杆菌耐药性逐年增加，且容易形成生物膜。本研究中的80株MDR-Ab中具有生物膜形成能力的菌株占97.5%，其中生物膜形成阳性菌株占57.5%，强阳性菌株占30%，这也间接说明了细菌多重耐药的原因之一可能跟生物膜的形成有关。有学者认为耐药菌株多形成生物膜的原因可能是细菌对抗菌药物压力的选择，同样它也可以在生物膜的环境下获得对多种抗菌药物的耐药性较高的定植能力与其对抗菌药物的耐药性有助于细菌本身的生存,但也有生物膜生成与细菌耐药性呈负相关的报道[10，11]。目前对这一结论也只是推断，尚无定论.另外细菌所形成生物膜除屏障作用外，它可以诱导机体补体的转化，抑制中性粒细胞趋化，抵抗吞噬细胞吞噬,使得生物膜中的鲍曼不动杆菌得以在藻酸盐的庇护下生长而不被清除，增强其抵御人体免疫防线的能力,当机体的免疫力低下时，极易发生感染[12，13]。

以生物膜方式生存的细菌对抗生素的耐药性逐渐增强，针对生物膜的研究以试图解决细菌耐药性的问题已刻不容缓[14]。磷霉素具有破坏耐药菌(包括鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌等)的生物被膜的功能和作用[15]。近年来单味中药、中药复方制剂、中药有效成分单体及其衍生物都取得了一定成果，金银花、五味消毒散、双黄连、五倍子醇提取液、人参单体等有破坏生物膜的作用[16-18]。本实验则选用替加环素来破坏鲍曼不动杆菌所形成的生物膜，通过酶标仪所测得的生物膜的OD值和共聚焦倒置显微镜高倍镜下观察生物膜的形态两种方式，结果发现替加环素能够破坏MDR-Ab所形成生物膜，且在亚抑菌浓度范围内破坏生物膜的能力呈现的趋势为浓度越大,破坏作用越强，但二者之间并不呈绝对相关性。因为在本实验中2 mg/L和1 mg/L浓度的替加环素组之间破坏生物膜的能力在统计学上并没有显示出显著性差异(P48 h=0.094,P96 h=0.063),但两者均与0.5 mg/L浓度的替加环素组在破坏生物膜能力上显示有差异(P48 h=0.001,0.422,P96 h=0.000,0.378),且2 mg/L与0.5 mg/L浓度的替加环素破坏生物膜能力的差异性更显著(P48 h=0.001,P96 h=0.000)，因此根据上述数据得出推论生物膜的破坏能力与替加环素的浓度呈正相关的趋势。本实验又进行了替加环素作用前后生物膜形态变化的比较。通过镜下观察48 h和96 h破膜后的形态变化，发现不加替加环素的阴性对照组形成的生物膜浓密，细菌密度大且聚集存在,最大浓度2 mg/L的替加环素作用组所形成的生物膜最稀薄，细菌散在分布,与上述所测得实验数据相吻合。综上所述，替加环素具有破坏成熟生物膜的能力，且与亚抑菌浓度范围内的替加环素的浓度大小大致呈正相关性。近年来，国内外学者研究发现，生物膜是鲍曼不动杆菌的重要毒力因子，能黏附在各种医疗器械表面而致病[19,20]。在临床上尽量不使用体内留置性医疗装置，例如导尿管、动静脉内留针、各部位的引流管、气管内插管、接触性眼镜、人造血管、人造心瓣膜以及其他人造器官等。对于必须使用的病人应尽量缩短使用时间或经常更换，或者使用经特殊理化方法制成的由抗细菌粘附生物材料构成的导管，或使用含有抗菌物质制成的导管[21]。Singh等发现乳铁蛋白通过结合铁离子使细菌进入一种移动状态，在移动时不易形成微菌落从而抑制BF发育，但BF一旦成熟，其作用也就不明显了[22]。可见对形成生物膜的鲍曼不动杆菌感染预防和治疗是一项综合且艰巨的任务,对于生物膜在细菌耐药中的作用以及生物膜所形成的机制仍需探索，本实验重点阐述了多重耐药的鲍曼不动杆菌可以形成生物膜及替加环素在亚抑菌浓度下可以破坏生物膜，为临床上对抗细菌耐药性提供理论依据。

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