二甲双胍对三阴乳腺癌细胞MDA-MB-231体外抑制作用的研究

侯俊杰,倪志强,杨 影,周 颖,谭 岩,方艳秋

(吉林省人民医院 肿瘤综合治疗科,吉林 长春130021)

二甲双胍对三阴乳腺癌细胞MDA-MB-231体外抑制作用的研究

侯俊杰,倪志强,杨 影,周 颖,谭 岩,方艳秋*

(吉林省人民医院 肿瘤综合治疗科,吉林 长春130021)

目的 探讨二甲双胍对三阴乳腺癌细胞的抑制作用和可能的损伤机制。方法 利用MTT、流式细胞仪检测二甲双胍对MDA-MB-231乳腺癌细胞周期的影响及诱导凋亡作用；应用Western blot技术检测加药后MDA-MB-231乳腺癌细胞外信号调节激酶1和2(ERK1 / 2)磷酸化表达水平变化。结果 不同浓度二甲双胍作用MDA-MB-231乳腺癌细胞系24、48 h后细胞增殖被不同程度抑制，并呈时间和浓度依赖性(P<0.05)；可促进MDA-MB-231乳腺癌细胞系凋亡，并呈浓度依赖性(P<0.05)；细胞周期检测，与对照组比较，G0/G1期比例增加(P<0.05)，S期比例逐渐降低(P<0.05)，G2/M期比例无明显变化(P>0.05)；药物处理MDA-MB-231乳腺癌细胞系24 h后，Western blot检测示随药物浓度的增加，细胞外信号调节激酶1和2(ERK1/2)磷酸化表达水平下降(P<0.05)。结论 二甲双胍对三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖有抑制作用，下调P-ERK1/2的表达可能是其抗肿瘤机制之一，可能成为三阴乳腺癌潜在的维持治疗药物。

二甲双胍;乳腺癌；损伤

三阴性乳腺癌(TNBC)是乳腺癌的亚型，其特异性地指缺乏雌激素受体、孕酮受体和人表皮生长因子受体-2表达的乳腺癌，发生率占乳腺癌的15%，常发生在40岁以下的女性，具有特殊的生物学行为特征，如高病理组织学分级、不良预后、3年复发率高、5年生存率低、侵袭性强、易局部复发和远处转移等[1]。 目前，TNBC已分为基底样TNBC(BL-TNBC)和非基底样TNBC(NB-TNBC)[2]。 因为无ER、PR的表达和缺乏HER-2过表达，TNBC对内分泌治疗和曲妥珠单抗的靶向治疗均无反应，化疗是TNBC的主要治疗手段，并且目前无有效且耐受性好的维持治疗药物，因此，相对于其它类型乳腺癌治疗手段有限，预后差。二甲双胍是一种抗糖尿病药物，也是一种公认的潜在抗肿瘤抗肿瘤药物。最近一项研究证明：二甲双胍能抑制MCF-7细胞的增殖、阻滞细胞周期和诱导细胞凋亡等[3]。然而，MCF-7细胞仅代表乳腺癌一种亚型，不能预知其对三阴乳腺癌细胞的治疗反应情况，鉴于这种情况，我们在体外观察二甲双胍对三阴乳腺癌细胞MDA-MB-231作用，探讨二甲双胍对三阴乳腺癌细胞的抑制作用和可能的损伤机制，为二甲双胍成为三阴乳腺癌维持治疗药物提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 细胞 MDA-MB-231细胞为我院医学诊治实验中心提供。

1.1.2 试剂及其来源 二甲双胍片剂(0.85 g/片)由中美上海施贵宝制药有限公司生产；DMEM培养液为Gibco公司产品；胎牛血清由四季青公司生产；MTT由上海绿鸟科技有限公司提供; 用于检测Annexin-V / PI细胞凋亡和PI单克隆细胞周期检测的试剂盒由BaoTech公司生产；兔抗人P-ERK1/2一抗由Cell Signaling 公司生产，鼠抗兔二抗为北京中杉金桥生物有限公司产品；RNA酶、TEMED，PVDF膜均购自鼎国公司; 分子量标记物购自Po-Tektronix；蛋白酶抑制剂Cocktail片剂购自Roche公司。定影剂，显影剂和胶片是柯达产品。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 将MDA-MB-231细胞在含有10%灭活的胎牛血清(含有2 mmol / L谷氨酰胺)的DMEM培养基中培养，并在37℃，5%CO2饱和湿度的培养箱中孵育。24-48 h传代1次，用0.25%胰蛋白酶消化传代继续培养，取对数生长期细胞进行实验。

1.2.2 MTT法检测 应用MTT法检测细胞增殖：在对数生长期收获MDA-MB-231细胞，以1×106/ml接种于96孔板，每孔100 μl，每组时设5个复孔，加入二甲双胍(终浓度10、20、40、80、160 mmol/L)作用24和48 h后，弃去上清，每孔加入20 μl MTT，在37℃、5%CO2和饱和湿度下培养4 h，加入(10%SDS 10 g+5%异丁醇5 ml+10 mol/L HCl 0.1 ml)过夜。 通过紫外分光光度计测量570 nm处的吸光度(A)值。 细胞增殖的抑制率计算如下：抑制率(%)=(1-实验组A值/对照A值)×100%。

1.2.3 Annexin V/PI染色法检测细胞凋亡 取生长对数期的细胞，调整细胞密度为1×106个/ml，接种于6孔板，每孔2 ml，分别加入不同浓度二甲双胍(终浓度分别为10、20、40、80 mmol/L)，每组设3个复孔，培养24 h收集各组细胞，按照PI单染说明书，上流式细胞仪检测细胞DNA含量，分析细胞周期。按照Annexin V/PI试剂盒说明书，取1×106个/ml细胞以PBS洗涤2次，加入5 μl AnnexinV-FITC，混匀后避光室温孵育10 min，4 ℃离心弃上清后，先后加入 AnnexinV-FITC 190 μl、PI 10 μl，避光冰浴反应10 min,经流式细胞仪(FACS)检测，用Cell Quest软件分析细胞凋亡率。实验重复3次。

1.2.4 PI单染色法检测细胞周期情况 在对数生长期将细胞密度调节至1×106个细胞/ml。将细胞接种在具有2 ml每个孔的6孔板中。 二甲双胍的终浓度分别为10,20,40 mmol / L和空白对照组。 在培养后24 h收集细胞。 根据PI染色的说明将细胞浓度调节至1×106个细胞/ml，离心5 min，弃上清，加入1 ml冰浴预冷PBS，轻轻摇动细胞悬液，再离心5 min，弃上清，每管样品中加入碘化丙啶染色液(预先配好)0.5 ml，缓慢并充分重悬细胞沉淀，37℃避光温浴30 min，24 h内通过流式细胞术检测，Cell Quest软件分析。

1.2.5 Western blot检测P-ERK1/2蛋白表达 将密度为1×106个/ml的MDA-MB-231细胞加入不同浓度二甲双胍溶液中，于37℃含5%CO2孵箱中孵育24 h后，冰PBS洗涤，加入RIPA裂解液，冰上裂解30 min，4℃下15 000转离心3 min，收集上清液测定蛋白浓度。取等量总蛋白进行SDS-PAGE的蛋白电泳、转膜、封闭、加入P-ERK1/2抗体，孵育过夜后加入二抗，再孵育、显色。结果使用图像处理器进行灰度分析，使用β-肌动蛋白作为内部参照。

使用SPSS18.3统计软件， 结果表示为平均值±标准差，独立样本t检验分析，P<0.05的差异有统计学意义。

2 结果

2.1 二甲双胍对MDA-MB-231细胞增殖抑制

MTT法检测不同浓度的二甲双胍对MDA-MB-231细胞不同时间后其吸光度A值的变化，绘制二甲双胍对细胞抑制率曲线(图1)。结果提示，二甲双胍对MDA-MB-231细胞的增殖抑制作用呈时间浓度依赖性，时间越长，浓度越大，抑制率越高。

图1 二甲双胍对MDA-MB-231细胞抑制率曲线

2.2 流式细胞仪PI法检测二甲双胍对MDA-MB-231细胞周期的影响

结果提示，随药物浓度增加，G0/G1期比例增加，S期比例逐渐降低，G2/M期比例无明显变化，提示二甲双胍对MDA-MB-231细胞阻滞在G1期(表1、图2)。

表1 二甲双胍作用24 h后MDA-MB-231细胞 周期变化

注：与阴性对照组比较，**P<0.01，*P<0.05

2.3 流式细胞仪AnnexinV/PI法检测细胞凋亡

通过AnnexinV/PI测定检测凋亡细胞(见表2，图3)。 结果表明，当浓度为10-80 mmol/L时，凋亡率随药物浓度的增加而增加，在80 mmol/L时达到最高(P<0.01)，与对照组比较，在药物浓度20-80 mmol/L之间时，诱导MDA-MB-231细胞凋亡呈药物浓度依赖性，差异有统计学意义 (P<0.01)。

图2 流式细胞仪PI法检测二甲双胍MDA-MB-231细胞周期影响

图3 不同浓度二甲双胍对MDA-MB-231细胞2凋亡影响

Concentrationofdrug(mmol/l)Earlyapoptoticrate(%)Totalapoptoticrate(%)0(control)100.41±0.03 3.41±0.51 1.21±0.30 7.37±0.92 2040808.23±0.38**11.27±1.31** 16.72±2.62** 15.77±2.94** 21.41±1.83**25.10±2.25**

注：与阴性对照组比较，**P<0.01

2.4 western bolt技术检测二甲双胍对P-ERK1/2蛋白表达的影响

不同浓度二甲双胍处理MDA-MB-231细胞24小时后，western blot检测P-ERK1/2的表达，光密度扫描。结果显示，随着药物浓度的增加P-ERK1 / 2蛋白表达下降 (图4)。

3 讨论

二甲双胍的抗肿瘤活性及其可能作为传统肿瘤治疗中的维持治疗药物，在许多类型的癌症中已经得到证实[4-6]。然而，二甲双胍对不同乳腺癌细胞谱

图4 western blot检测P-ERK1/2的表达

系的作用仍然知之甚少。因此，应用乳腺癌细胞系MDA-MB-231来验证二甲双胍的作用。本实验证实，二甲双胍能够抑制乳腺癌细胞系MDA-MB-231的增殖，且其作用呈现时间剂量依赖性，与常见实体肿瘤细胞横向比较，本研究的抑制率高于相关研究[7]，同时该药可诱导MDA-MB-231细胞凋亡、G1/S期阻滞，并抑制MDA-MB-231乳腺癌细胞外磷酸化信号调节激酶1和2(P-ERK1 / 2)的表达。

目前，细胞周期阻滞的机制受到越来越多的关注。 细胞周期阻滞也是肿瘤治疗的重要靶标。 G1/S是细胞周期细胞分裂和增殖中最重要的调节点。 如果在G1/S期发生异常，可能导致正调节功能过度增强或负调节功能减弱或缺失，从而诱导肿瘤发生[8]。 此外，G1/S也是DNA复制、损伤和修复的关键时期，当损伤的DNA可以修复时，则继续存活，如果DNA损伤不能有效修复，则细胞开始凋亡程序[9- 10]，所以调节细胞周期并促进其凋亡已成为治疗肿瘤的靶标之一。本实验说明随二甲双胍药物浓度的增加MDA-MB-231乳腺癌细胞G0/G1期百分比亦逐渐升高，S期百分比逐渐下降，G2/M期变化无统计学意义，提示在二甲双胍的作用下，可能影响了MDA-MB-231乳腺癌细胞的细胞周期分布，使大多数细胞阻滞在G0/ G1期，阻碍其向S期转化，阻滞了细胞的DNA合成及有丝分裂，因此抑制了MDA-MB-231乳腺癌细胞增殖，所以，二甲双胍对MDA-MB-231乳腺癌细胞周期的调节是其抑制肿瘤细胞增殖的机制之一。

P-ERK1/2的已被认为是在肿瘤细胞的迁移和侵袭的关键分子之一，是丝裂原活化蛋白激酶的重要成员 (MAPK)家族之一，也是IGF1/MEK/P-ERK/S6通路上关键调节因子之一，在促进肿瘤细胞增殖、迁移、细胞因子分泌等方面起到至关重要的作用[11-14]。

本研究在不同浓度二甲双胍处理细胞24小时后， Western blot检测提示：随药物浓度的增加，磷酸化的细胞外信号调节激酶1和2(P-ERK1/2)表达下降，以上研究结果表明：二甲双胍作用MDA-MB-231乳腺癌细胞24小时后，抑制了P-ERK1/2蛋白合成，由于P-ERK1/2是肿瘤生长信号通路IGF1/MEK/P-ERK/S6中关键正性调控因子及调节酶，所以二甲双胍可能通过下调P-ERK1/2表达，必然干扰了该通路信号传导，直接和或间接地破坏了肿瘤微环境，从而起到抑制三阴乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖作用。

综上所述，二甲双胍可能通过直接抑制MDA-MB-231细胞P-ERK1/2蛋白合成、干扰或阻断IGF1/MEK/P-ERK/S6通路、阻滞细胞的G1/S期等对MDA-MB-231细胞系行多途径、多靶点抑制。

目前，乳腺癌发病率在全球范围内逐年增加且年轻化[15]，虽然新药及临床试验层出不穷，主要针对激素依赖性乳腺癌，而对三阴乳腺癌复发耐药及维持治疗等方面并不乐观，缺少有效既经济又耐受性良好的维持治疗药物。二甲双胍是II型糖尿病治疗的一线药物，目前研究证明，其为“多用途”药物，除能调节血糖外，被证实其新用途是能抑制肿瘤细胞增值、促进肿瘤细胞凋亡、阻滞细胞周期等，具有广泛抗瘤活性[16]，且廉价，患者易耐受，利于临床应用。因此，根据二甲双胍对三阴乳腺癌细胞的抗瘤机制及三阴乳腺癌发病机制，二甲双胍有可能成为三阴乳腺癌潜在的临床维持治疗药物。

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本文受吉林省卫生计生委项目(NO.20132093)资助

1007-4287(2017)02-0295-05

R737.9

A

侯俊杰(1979-) ，男，主治医师，主要从事肿瘤综合治疗方面的研究；方艳秋(1968-) ，女，博士，教授，主要从事 恶性肿瘤的诊断与治疗的临床与科研工作。

2016-11-08)

*通讯作者