大豆胰蛋白酶抑制剂的制备及性质

程芬芬，刘 春，杨晓泉*

（华南理工大学食品科学与工程学院食物蛋白工程研究中心，广东 广州 510640）

大豆胰蛋白酶抑制剂的制备及性质

程芬芬，刘 春，杨晓泉*

（华南理工大学食品科学与工程学院食物蛋白工程研究中心，广东 广州 510640）

采用硫酸钠盐析法从大豆乳清废水中选择性回收大豆胰蛋白酶抑制剂（soybean trypsin inhibitor，STI），且以商品化的Kunitz型胰蛋白酶抑制剂（soybean Kunitz trypsin inhibitor，KTI）为对照表征STI的理化性质和界面性质。结果表明，STI提取优化条件为：乳清溶液固形物含量13%、pH 4、加盐量9 g/100 mL，此条件下STI的得率为20.54%；十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱显示，其主要成分为KTI，以苯甲酰-DL-精氨酸-p-硝基酰替苯胺盐酸盐为底物的胰蛋白酶抑制活力为2 135.00 TIU/mg，且具有良好的温度和pH值稳定性（80 ℃加热30 min后仍保持73.19%的抑制活力，在pH 2～11范围内抑制活力无明显变化）；傅里叶变换红外光谱和圆二色性结果显示，其与KTI（Sigma T9218）的结构类似，二级结构主要是β-折叠和无规卷曲；界面性质数据表明，STI分子能很快吸附到气水界面形成高弹性界面，从而使其具有良好的起泡性和泡沫稳定性。因此，简单的硫酸钠盐析法是大规模制备高纯度且功能性质良好的STI的有效方法，所获得的STI在医药及功能性食品领域有潜在的应用价值。

大豆乳清废水；盐析法；胰蛋白酶抑制剂；理化性质；界面性质

大豆分离蛋白生产过程中会产生大量的乳清废水，因其化学需氧量和生化需氧量值高，直接排放会造成严重的环境污染，现代工业通常利用好氧或者厌氧的方法对废水进行消化处理，使其达到污水排放标准后排放，这种处理方法不仅需要一定的运行成本，而且造成了资源浪费，无法利用乳清废水中的多种生物活性物质。大豆乳清蛋白（soybean whey proteins，SWP）是大豆乳清废水中的酸溶蛋白，占大豆蛋白的10%左右，主要成分是脂肪氧化酶（102 kD）、β-淀粉酶（61.7 kD）、大豆凝集素（33 kD）、Kunitz型胰蛋白酶抑制剂（soybean Kunitz trypsin inhibitor，KTI，20 kD）和Bowman-Birk型胰蛋白酶抑制剂（Bowman-Birk inhibitor，BBI，7.9 kD）[1]。大豆胰蛋白酶抑制剂（soybean trypsin inhibitor，STI）是大豆中的主要抗营养因子，因此最初对其抗营养特性进行了广泛的研究，但后来越来越多的证据表明这类蛋白质有特殊的生物活性如抗致癌、抗炎等功能，在功能食品和医药等领域具有广泛的应用前景[2]。

对于胰蛋白酶抑制剂的分离工作，目前实验室水平有水浸、酸提、盐析等方法，再用纯化效率较高的色谱法进一步纯化，且多为2 种以上的色谱法结合使用，如离子色谱与排阻色谱结合，或离子色谱与亲和色谱相结合等。利用胰蛋白酶固定于色谱柱的填料中，制成亲和色谱柱，利用这种固定化酶技术可实现对胰蛋白酶抑制剂的一步式纯化[3-4]。但由于成本高、得率低，现阶段这种纯化方法尚未得到广泛应用。

盐析法是一种经典且可放大的蛋白质分级分离技术，该法流程简单、成本低廉，其原理是蛋白质在高浓度的盐溶液中，随着盐浓度的逐渐增加，蛋白质表面的水化膜被破坏，溶解度下降而从溶液中沉淀析出。由于不同蛋白质的溶解度各异，因而可利用不同浓度的盐溶液来沉淀分离各种蛋白质。盐析法条件温和、操作简便，无需特定的仪器设备，是沉淀蛋白质经常使用的方法。已有一些研究利用盐析法来提取胰蛋白酶抑制剂，但都是胰蛋白酶抑制剂的粗提取，得到的胰蛋白酶抑制剂纯度不高，需要进一步纯化。

STI是一种具有特殊生物活性的蛋白质，进一步研究其理化性质及界面性质非常重要。近年来，对胰蛋白酶抑制剂的理化性质报道较多，许多研究表明，胰蛋白酶抑制剂对热、酸环境相对稳定。Chaudhary等[5]利用圆二色光谱分析了胰蛋白酶抑制剂的热稳定性，Donovan等[6]则利用差示扫描热量法探究了STI的热稳定性。Bueno等[7]研究了茯苓胰蛋白酶抑制剂，发现其有很好的温度稳定性及pH值耐受性。迄今，有少量报道涉及胰蛋白酶抑制剂的乳化性质和泡沫性质，但鲜见胰蛋白酶抑制剂在气水界面的吸附动力学和界面黏弹性方面的报道，而蛋白质降低表面张力的能力及其在界面上的稳定性与乳液/泡沫的形成能力和稳定性密切相关[8]。通常，蛋白质通过在油水/气水界面上的吸附来降低界面自由能，在液滴表面形成具有一定强度的凝胶化界面层来维持乳液/泡沫的稳定性。

本实验旨在利用工艺简单、成本低廉的盐析法来分离出纯度高、性质优良的STI，研究其温度及pH值稳定性和二级结构等理化性质，并采用动态滴形分析法结合振荡滴技术，研究STI在气水界面的吸附特性和黏弹特性，分析其界面性质与泡沫性质的相关性，以期为STI的进一步利用提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

低温脱脂大豆粕 山东新嘉华股份有限公司；苯甲酰-DL-精氨酸-p-硝基酰替苯胺盐酸盐（Nα-benzoyl-DL-arginine 4-nitroanilide hydrochloride，BAPNA）、胰蛋白酶（1∶250，酶活力＞250 NFU/mg）、KTI（T9128）美国Sigma公司；标准分子质量蛋白 上海升正生物技术有限公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

EL204精密电子天平 德国Sartorious公司；Brion 3 STAR精密pH计 美国Thermo公司；薄膜蒸发仪 日本EYELA东京理化器械株式会社；2WAJ 阿贝折光仪 上海索光光电技术有限公司；CR22G高速冷冻离心机 日本Hitachi公司；UV-2450分光光度计 日本Shimadzu公司；DELTA冷冻干燥机 德国Christ公司；Mini-Sub Cell电泳槽、电泳仪 美国Bio-Rad公司；OCA20视频光学接触角测量仪 德国Dataphysics公司；VERTEX 70红外光谱仪 德国Bruker公司；MOS450旋光仪 法国BioLogic公司；杜马斯定氮仪 法国Elementar公司。

1.3 方法

1.3.1 回收大豆乳清中胰蛋白酶抑制剂

1.3.1.1 大豆乳清废水的制备

将脱脂豆粕与水按1∶10（m/V）的比例混合，在室温（25±2）℃条件下搅拌30 min。离心后除去不溶性物质后，用HCl溶液调节上清液至pH 4.5以沉淀酸不溶性蛋白，得到的上清液即为大豆乳清废水。

1.3.1.2 盐析法回收大豆乳清中胰蛋白酶抑制剂

用薄膜蒸发仪将大豆乳清废水浓缩到特定浓度，用阿贝折光仪估算浓缩液中的固形物含量，根据固形物含量向浓缩乳清中添加特定量的盐，并将浓缩液的pH值调至特定值，冷藏（4 ℃）过夜，然后离心回收酸性条件下析出的凝集沉淀物。流程图见图1。

图1 盐析法回收胰蛋白酶抑制剂流程图Fig.1 Flow chart for STI preparation by salting out method

1.3.1.3 盐析条件优化

根据盐析的基本原理，对盐析时乳清溶液的pH值、加盐量和固形物含量3 个因素进行优化。盐析时，一般盐析液的pH值越接近蛋白的等电点，蛋白越易于沉淀析出，大豆两种主要的胰蛋白酶抑制剂KTI和BBI的等电点分别为4.5和4.2，所以固定盐析液的pH值为4对加盐量和乳清固形物含量进行优化。1）加盐量对盐析效果的影响：固定盐析液的固形物含量为13%（质量分数），加盐量分别设为乳清溶液的1、3、6、9、14 g/100 mL；2）乳清的固形物含量对盐析效果的影响：固定盐析液的加盐量为9 g/100 mL，乳清的固形物含量分别设为5%、9%、13%、17%和21%。3）pH值对盐析效果的影响：固定乳清的固形物含量为13%，加盐量为乳清溶液质量的9 g/100 mL，盐析液的pH值设为2、3、4、5、6共5 个梯度；每个单因素试验重复3 次。

1.3.2 蛋白质含量的测定

回收得到的STI的蛋白质含量采用杜马斯定氮法[9]测定。

1.3.3 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定分离效果和蛋白组分纯度分析

十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）分析采用Laemmli[10]的方法，采用不连续垂直板状凝胶电泳。凝胶厚度1 mm，浓缩胶质量浓度为5 g/100 mL，分离胶质量浓度为12 g/100 mL。每个样品槽中加入10 μg样品，于恒流下进行电泳，样品在浓缩胶中电流为10 mA，进入分离胶后电流调为20 mA。电泳结束后将凝胶置于考马斯亮蓝R-250的染色液中染色45 min，之后使用甲醇-乙酸脱色液（甲醇-乙酸-水体积比为1∶1∶8）进行脱色。

1.3.4 胰蛋白酶抑制剂活力的测定

胰蛋白酶抑制剂的测定主要有荧光法、BAPNA法和苯甲酰-L-精氨酸乙酯法，其中BAPNA法是美国化学协会推荐的方法。本实验STI活力的测定参照Gogoi等[11]的操作方法，并稍作修改，采用10 mL体系的BAPNA法测定胰蛋白酶抑制剂的抑制活力[11-12]。

1.3.4.1 试剂配制

0.04 g/100 mL BAPNA溶液：称取BAPNA 40 mg溶于1 mL二甲亚砜中，并将Tris-HCl缓冲溶液预热至37 ℃作为溶剂将上述试剂稀释至100 mL，当天使用；0.01 g/100 mL胰蛋白酶溶液：称取胰蛋白酶10 mg，转移至100 mL容量瓶中，用0.001 mol/L HCl溶解定容，置于4 ℃冰箱，可存储5 d；体积分数30%醋酸溶液：30 mL冰醋酸蒸馏水稀释至100 mL。

1.3.4.2 胰蛋白酶抑制剂活力测定

样品空白和试剂空白：分别将2.00 mL样品稀释液和2.00 mL蒸馏水加入10 mL试管中。在37 ℃条件下保温10 min，各加入5.00 mL BAPNA溶液，混合后在37 ℃条件下保温10 min，分别加入1.00 mL 30%醋酸溶液中止反应，混合均匀后各加入2.00 mL胰蛋白酶溶液。

样品和标准：分别吸取2.00 mL去离子水（作标准）和2.00 mL稀释液于10 mL试管内，加入5.00 mL BAPNA溶液后在37 ℃条件下保温10 min，加入2.00 mL胰蛋白酶溶液，然后在水浴中保温10 min，再加1 mL 30%醋酸溶液中止反应。

每个样品设3 个重复，每个重复设两个平行反应，以3 个重复的平均测定结果以±s表示样品中胰蛋白酶抑制剂的活力。胰蛋白酶抑制剂活力单位（TIU）的定义：在410 nm波长处的吸光度减少0.01时为1 个胰蛋白酶活力抑制单位。

式中：A0、A1、A2分别为空白溶液、样品溶液、标准溶液在410 nm 波长处的吸光度；N为稀释倍数；m为样品质量/mg。

1.3.5 胰蛋白酶抑制剂的理化性质测定

1.3.5.1 STI的温度稳定性

配制1 g/100 mL STI溶液，调节pH值至7，分别置于40、60、80、100 ℃水浴锅中，加热30 min后，冷却至室温，BAPNA法测定STI的剩余活力，每个样品重复3 次，每次2 个平行。作出STI剩余活力与温度的关系曲线图，分析温度对STI活力的影响。以KTI（Sigma T9128）作对照。

1.3.5.2 STI的pH值稳定性

配制1 g/100 mL STI溶解于pH 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11的广泛pH值缓冲液中，室温条件下保温30 min后，立即调节pH值至7，BAPNA法测定STI剩余活力，每个样品重复3 次，每次2 个平行。作出STI剩余活力与pH值的关系曲线图，分析不同pH值对STI活力的影响。以KTI（Sigma T9128）作对照。

1.3.5.3 STI的傅里叶变换红外光谱分析

将冻干样品置于干燥器内用P2O5充分干燥，称取样品1 mg，与100 mg溴化钾研磨混匀压片测定红外光谱。在数据采集期间，为了减少水蒸汽红外光谱吸收的干扰，持续用干燥的N2淋洗测量室。在与样品测定完全相同的条件下在室温敞开状态收集空气背景。Bruker VERTEX 70光谱仪测定在波数范围为4 000～400 cm－1的吸收光谱，分辨率4 cm－1，环境温度25 ℃[13]。以KTI（Sigma T9128）作对照。

1.3.5.4 STI的圆二色性分析

用法国BioLogc公司的MOS450旋光仪测定STI的远紫外圆二色性（circular dichroism，CD）分析。样品溶于pH 7的10 mmol/L磷酸钠缓冲液中至蛋白质量浓度0.1 mg/mL，将样品注入0.2 cm厚的比色皿中，比色皿光径1 mm，分辨率0.2 nm，在25 ℃和连续充氮的条件下，进入远紫外区域（190～250 nm）进行扫描，速率20 nm/min，光谱间隔0.1 nm，3 次累积，利用CD Pro软件中的CDSSTR软件分析光谱估算STI二级结构中α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规卷曲所占比率[13-14]。以KTI（Sigma T9128）作对照。

1.3.6 胰蛋白酶抑制剂界面性质的测定

1.3.6.1 界面张力的测定

采用动态滴形分析法检测气水界面上的界面张力（γ）随吸附时间（t）的变化。测系统为OCA20视频光学接触角仪，实验时，将1 g/100 mL STI溶液置于注射器中，静置至样品温度平衡，由电动注射单元通过毛细管推入样液，在针尖上形成15 μL的液滴。视频摄像系统立即采集液滴的外形图像，检测界面张力随吸附时间的变化[15-16]。测定时间为10 000 s。在检测过程中，应避免外界振动干扰测量。以KTI（Sigma T9128）作对照。

1.3.6.2 界面膜扩张流变性质的测定

采用动态滴形分析结合振荡滴技术，研究天STI在气水界面上的界面扩张弹性模量（Ed）随吸附时间（t）的变化，详见王金梅[17]方法。检测系统为带有ODG20P振荡发生器的OCA20视频光学接触角测量系统。实验时，将连接在毛细管上的不锈钢针（外径1.65 mm、内径1.19 mm）插入玻璃槽内。将1 g/100 mL STI溶液置于注射器中，静置至样品温度平衡，由电动注射单元通过毛细管推入样液，在针尖上形成 10 μL的液滴，液滴形成以后，使用振荡发生器对其施以周期性正弦振荡，液滴的表面积（A）发生微小变化（扩张应变），此时视频摄像系统采集液滴外形图象，然后由系统软件进行图象分析。以KTI（Sigma T9128）作对照。

1.3.6.3 泡沫性质的测定

将STI在分散在10 mmol/L磷酸盐缓冲液中至质量浓度为1 g/100 mL，调节pH值至7，取溶液体积15 mL置于直径4 cm的带刻度玻璃管中，剪切搅拌器搅打1 min，立即记录每分钟泡沫体积的变化，并拍照记录，观察泡沫在容器中变化情况，作泡沫体积随时间的变化曲线[18-19]。取KTI（Sigma T9128）作对照。

2 结果与分析

2.1 盐析法选择性回收胰蛋白酶抑制剂

2.1.1 加盐量对盐析效果的影响

表1 不同加盐量时STI的得率及胰蛋白酶抑制活力Table1 The yield and trypsin inhibitory activity of STI with addition of different amounts of sodium sulfate

由表1可知，随着加盐量的增加STI得率呈增加的趋势，在加盐量为9 g/100 mL时最大，但与加盐量为14 g/100 mL时差别不明显；胰蛋白酶抑制剂的抑制活力在加盐量为9 g/100 mL时达到最大；不同加盐量时SDSPAGE图（图2）显示不同梯度的加盐量提取出的产品均含有胰蛋白酶抑制剂，但是1、3、6 g/100 mL条带中除了胰蛋白酶抑制剂还有很多其他的杂蛋白，9 g/100 mL和14 g/100 mL中胰蛋白酶抑制剂的纯度较高，差异不大，为了节约成本，选择加盐量为乳清溶液固形物含量的9 g/100 mL时最好。综上分析，选择加盐量为9 g/100 mL。

图2 不同加盐量时STI的SDS-PAGE图Fig.2 SDS-PSGE analysis of STI salted out with different salt concentrations

2.1.2 乳清的固形物含量对盐析效果的影响

表2 不同固形物含量时STI的得率及胰蛋白酶抑制活力Table2 The yield and trypsin inhibitory activity of STI from soybean whey with different solid contents

由表2可知，随着乳清溶液固形物含量的增加STI得率呈上升趋势，在固形物含量为21%时达到最大；胰蛋白酶抑制活力随着固形物含量的增加先增大后降低，在固形物含量13%时达到最大；不同固形物含量所得到的SDS-PAGE图见图3，各样品的产物均有胰蛋白酶抑制剂的条带，且杂蛋白的含量均较少，但是比较而言，固形物含量为13%时纯度最高，分离效果最好。综上分析，在固形物含量为13%时，得率较高，胰蛋白酶抑制剂活力最大。

图3 不同固形物含量时STI的SDS-PAGE图Fig.3 SDS-PSGE analysis of STI from soybean whey with different solid contents

2.1.3 pH值对盐析效果的影响

表3 不同pH值时STI的得率及胰蛋白酶抑制活力Table3 The yield and trypsin inhibitory activity of STI salted out at differenntt ppHH

由表3可知，STI得率在pH 4时达到最大，胰蛋白酶抑制活力在pH值梯度间差异显著，在pH 4抑制活力达到最大；不同pH值所得到组分的SDS-PAGE图见图4。各pH值条件下均有胰蛋白酶抑制剂的条带，但是pH 2、3、5、6条带中除了胰蛋白酶抑制剂还有很多其他的杂蛋白，如凝集素、β-淀粉酶、脂氧酶等，根据该电泳图可知，在pH 4时胰蛋白酶抑制剂浓缩物的纯度最高。综上分析，蛋白质在等电点附近时，蛋白质的溶解度最小而容易沉淀出来，STI得率及以胰蛋白酶抑制活力均最高，因此盐析时应将pH值调节在目的蛋白质的等电点附近，即pH 4最好。

图4 不同pH值时STI的SDS-PAGE图Fig.4 SDS-PSGE analysis of STI salted out at different pH

2.1.4 优化实验结果

图5 STI和KTI（Sigma T9128）的SDS-PAGE图谱Fig.5 SDS-PSGE analysis of STI and KTI (Sigma T9128)

综合单因素试验结果，确定出最佳的盐析工艺为：盐析的pH 4、乳清溶液固形物含量13%、加盐量9 g/100 mL时，STI的得率最高，为20.54%（基于乳清溶液的固形物含量），蛋白质含量为88.5%。回收得到的STI胰蛋白酶抑制活力为2 135.00 TIU/mg，SDS-PAGE图谱如图5所示。可知STI的胰蛋白酶抑制活力略高于标准品KTI（Sigma T9128，1 935.50 TIU/mg），而原料SWP（冷冻干燥）的胰蛋白酶抑制活力只有12.30 TIU/mg。由图5可知，提取出的STI主要成分是KTI，只含有微量的BBI，几乎不含其他蛋白质，纯度较高，而KTI（Sigma T9128）中除了KTI和BBI之外，还有少量的杂蛋白。所以，通过简单的盐析法，可以得到纯度高、胰蛋白酶抑制活力高的胰蛋白酶抑制剂。

2.2 胰蛋白酶抑制剂的理化性质

2.2.1 温度对STI抑制活力的影响

图6 STI和KTI（Sigma T9128)的温度稳定曲线Fig.6 Temperature stability prof i les of STI and KTI (Sigma T9128)

盐析法提取出的STI温度稳定性如图6所示，随着温度的升高，STI的抑制活力有所下降，加热温度大于80 ℃后，STI的抑制活力急剧下降，说明80 ℃以上的加热温度对STI具有明显的失活作用，STI在40～80 ℃的范围内均保持较高的活力，在80 ℃加热30 min，STI仍然能保持73.19%的抑制活力；与对照KTI（Sigma T9128）相比，在温度低于80 ℃时，两者具有相似的温度稳定性，但当温度大于80 ℃时，KTI（Sigma T9128）的温度稳定性优于盐提STI。

2.2.2 pH值对STI抑制活力的影响

图7 STI和KTI（Sigma T9128）的pH值稳定曲线Fig.7 pH Stability prof i les of STI and KTI (Sigma T9128)

pH值对STI抑制活力的影响如图7所示，随着pH值的变化，STI的抑制活力没有明显的变化，与KTI（Sigma T9128）类似，说明STI具有较好的pH值稳定性。这一结果与已有文献报道相似。Macedo等[20]报道野生月桂印加豆胰蛋白酶抑制剂的抑制活力在pH 2～10范围内没有明显区别。Batista等[21]对青皮象耳豆胰蛋白酶抑制剂（EcTI）pH稳定性的研究也证明了这一结论。

2.2.3 傅里叶变换红外光谱分析

图8 STI和KTI（Sigma T9128）的傅里叶变换红外光谱图Fig.8 FTIR spectra of STI and KTI (Sigma T9128)

由STI和KTI（Sigma T9128）的红外光谱图可知（图8），STI的光谱相对于KTI（Sigma T9128）来说变化不大。在酰胺Ⅰ带中，1 649.45 cm－1处有明显的峰，说明分子中存在无规卷曲结构，在酰胺Ⅰ带的1 651～1 660、1 661～1 700 cm－1和酰胺Ⅲ带的1 290～1 300、1 265～1 295 cm－1处没有峰，说明分子中可能没有或者含有少量的α-螺旋及β-转角结构；酰胺Ⅲ带的1 250～1 220 cm－1处有明显的峰，说明有β-折叠的存在[22-23]。所以，STI和KTI（Sigma T9128）分子主要的结构可能是β-折叠和无规卷曲。

2.2.4 CD分析

图9 STI和KTI（Sigma T9128）的CD谱图Fig.9 Circular dichroism spectra of STI and KTI (Sigma T9128)

CD是表征蛋白质分子二级结构经典且常用的方法[5]，STI和KTI（Sigma T9128）的CD谱图如图9所示，STI和KTI（Sigma T9128）二级结构（α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规卷曲）的组成比例如表4所示。从图9可以看出，STI和KTI（Sigma T9128）均在200 nm附近有单一吸收负峰。从表4可以看出，α-螺旋的比例都很低，而β-折叠和无规卷曲的比例较高，说明胰蛋白酶抑制剂蛋白分子结构可能主要是以β-折叠和无规卷曲为主的二级结构，这与FTIR的结果相对应。黄惠华等[24]用远紫外CD对STI进行分析，发现STI和BBI的单一吸收负峰在200 nm波长处，其二级结构由22.5%的β-折叠、16.5%的β-转角和61.4%无规卷曲组成，也是以β-折叠和无规卷曲为主的二级结构。

表4 CDSSTR计算出的STI、KTI（Sigma T9128）的二级结构含量Table4 Secondary structure contents of STI and KTI calculated by CDSSTR program %

2.3 胰蛋白酶抑制剂的界面性质

2.3.1 动态界面张力

图10 STI和KTI（Sigma T9128）溶液气水界面的表面张力（γ）随时间的变化Fig.10 Surface tension (γ) as a function of time for STI and KTI (Sigma T9128) at the air-water interface

图10 为STI和KTI（Sigma T9128）溶液气水界面的表面张力（γ）随吸附时间的变化，表面张力随着吸附时间的延长而逐渐减小，这与表面活性物质在界面上的吸附密切相关。在吸附初期，表面张力快速下降，说明蛋白质快速吸附到界面上，形成了较稳定的网络层，随后，表面张力趋于稳定[25]。由图可知KTI（Sigma T9128）的表面张力小于盐提STI，说明KTI（Sigma T9128）更容易吸附到界面上，可能的原因是盐提KTI中还有一小部分为非蛋白的成分，从而导致相同浓度的样品，STI中的蛋白浓度要略小一些，最终吸附到界面上的蛋白与KTI（Sigma T9128）相比也要少一些。

2.3.2 界面膜扩张流变性质

图11 STI和KTI（Sigma T9128）弹性模量（Ed）随时间的变化Fig.11 Time-dependent dilatational elasticity (Ed) for adsorbed layers formed from STI and KTI (Sigma T9128) at the air-water interface

图11为STI和KTI（Sigma T9128）吸附过程中弹性模量（Ed）随吸附时间的动态变化。对STI和KTI（Sigma T9128），Ed随着吸附时间的延长而逐渐增加，主要是因为蛋白质吸附和强的分子间相互作用和界面的构象变化，弹性模量大表示强的界面网络的形成[26-27]。气水界面的吸附初期，STI相比较于KTI（Sigma T9128）呈现了较高的Ed值，表示蛋白快速向界面扩散和吸附，形成了更为稳定的界面网络，但最终两者的弹性模量相近，均达到约45.00 mN/m。

2.3.3 STI的泡沫性质

蛋白质稳定泡沫主要是通过在泡沫表面形成高弹性网络来实现的[28-29]，STI是大豆乳清蛋白中的主要成分，同大豆乳清蛋白相似，具有较好的起泡能力（有大于3 倍的体积膨胀率）和长时间的稳泡能力[30]。STI和KTI（Sigma T9128）起泡性和泡沫稳定性如图12所示，图13为泡沫在不同时间的泡沫体积图，显示在15 min后泡沫没有明显的粗化与聚结，在90 min时，STI泡沫体积仍有其初始体积的2/3，优于KTI（Sigma T9128）的泡沫稳定性。表明盐提STI具有较好的泡沫性质。这些结果与表面张力及弹性模量随时间变化的结果相符。

图12 STI和KTI（Sigma T9128）的泡沫性质Fig.12 Foaming properties of STI and KTI (Sigma T9128)

图13 不同时间的STI和KTI（Sigma T9128）泡沫体积图Fig.13 Bubble volume of STI and KTI (Sigma T9128) at different time points

3 结 论

本实验通过优化后的硫酸钠盐析法获得了较高纯度的STI，其主要成分是胰蛋白酶抑制剂KTI。以商业化的KTI（Sigma T9128）为对照，盐析法获得的STI具有与KTI（Sigma T9128）相似的分子结构、温度稳定性和pH值稳定性；具有较好的界面性质和泡沫性质。盐析法回收胰蛋白酶抑制剂的工艺简单、成本低廉，是一种大规模制备高纯度且功能性质良好的STI的有效方法，所获得的STI在医药及功能性食品领域有潜在的应用价值。

[1] LI Xingfei, DONG Die, HUA Yufei, et al. Soybean whey protein/ chitosan complex behavior and selective recovery of Kunitz trypsin inhibitor[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2014, 62(29)：7279-7286. DOI：10.1021/jf501904g.

[2] KOBAYASHI H. Prevention of cancer and inf l ammation by soybean protease inhibitors[J]. Frontiers in Bioscience, 2013, 5： 966-973. DOI：10.2741/E676.

[3] DURANTI M, BARBIROLI A, SCARAFONI A, et al. One-step purif i cation of Kunitz soybean trypsin inhibitor[J]. Protein Expression and Purification, 2003, 30(2)： 167-170. DOI：10.1016/S1046-5928(03)00106-2.

[4] PAIVA P M G, SOUZA A F, OLIVA M L V, et al. Isolation of a trypsin inhibitor from Echinodorus paniculatus seeds by affinity chromatography on immobilized Cratylia mollis isolectins[J]. Bioresource Technology, 2003, 88(1)： 75-79. DOI：10.1016/S0960-8524(02)00272-9.

[5] CHAUDHARY N S, SHEE C A, AHMAD F, et al. Purification and characterization of a trypsin inhibitor from Putranjiva roxburghii seeds[J]. Phytochemistry, 2008, 69(11)： 2120-2126. DOI：10.1016/ j.phytochem.2008.05.002.

[6] DONOVAN J W, BEARDSLEE R A. Heat stabilization produced by protein-protein association. A differential scanning calorimetric study of the heat denaturation of the trypsin-soybean trypsin inhibitor and trypsin-ovomucoid complexes[J]. Journal of Biological Chemistry, 1975, 250(6)： 1966-1971.

[7] BUENO N R, FRITZ H, AUERSWALD E A, et al. Primary structure of Dioclea glabra trypsin inhibitor, DgTI, a Bowman-Birk inhibitor[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications, 1999, 261(3)： 838-843. DOI：10.1006/bbrc.1999.1099.

[8] RUÍZ-HENESTROSA V P, SÁNCHEZ C C, ESCOBAR M D M Y, et al. Interfacial and foaming characteristics of soy globulins as a function of pH and ionic strength[J]. Colloids and Surfaces A：Physicochemical and Engineering Aspects, 2007, 309(1/2/3)： 202-215. DOI：10.1016/j.colsurfa.2007.01.030.

[9] 袁杨. 食物蛋白与壳聚糖相互作用及其在食品体系的应用研究[D].广州： 华南理工大学, 2014： 32-33.

[10] LAEMMLI U K. Cleavage of structural proteins during assembly of head of bacteriophage-T4[J]. Nature, 1970, 227： 680-685. DOI：10.1038/227680a0.

[11] GOGOI R N U K. Reduction in trypsin inhibitor activity in jatropha cake by chemical, thermal and radiation treatment[J]. Research Journal of Chemical Sciences, 2014, 1(4)： 17-19.

[12] LIU K, MARKAKIS P. An improved colorimetric method for determining antitryptic activity in soybean products[J]. Cereal Chemistry, 1989, 66(5)： 415-422.

[13] ZOU Yuan, GUO Jian, YIN Shouwei, et al. Pickering emulsion gels prepared by hydrogen-bonded zein/tannic acid complex colloidal particles[J]. Journal of Agricultural & Food Chemistry, 2015, 63(33)：7405-7414. DOI：10.1021/acs.jafc.5b03113.

[14] HASNI I, BOURASSA P, HAMDANI S, et al. Interaction of milk αand β-caseins with tea polyphenols[J]. Progress in Brain Research, 2011, 126(6)： 630-639. DOI：10.1016/j.foodchem.2010.11.087.

[15] LIU Chun, CHENG Fenfen, SUN Yingen, et al. Structure-function relationship of a novel PR-5 protein with antimicrobial activity from soy hulls[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2016, 64(4)：948-959. DOI：10.1021/acs.jafc.5b04771.

[16] KANAKIS C D, HASNI I, BOURASSA P, et al. Milk β-lactoglobulin complexes with tea polyphenols[J]. Food Chemistry, 2011, 127(3)：1046-1055. DOI：10.1016/j.foodchem.2011.01.079.

[17] 王金梅. 大豆蛋白热聚集行为及界面、乳化性质研究[D]. 广州： 华南理工大学, 2012： 44-58.

[18] WAN Zhili, WANG Liying, WANG Jinmei, et al. Synergistic foaming and surface properties of a weakly interacting mixture of soy glycinin and biosurfactant stevioside[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2014, 62(28)： 6834-6843. DOI：10.1021/jf502027u.

[19] MURRAY B S. Stabilization of bubbles and foams[J]. Current Opinion in Colloid & Interface Science, 2007, 12(Suppl 4/5)： 232-241. DOI：10.1016/j.cocis.2007.07.009.

[20] MACEDO M L R, VIVIANE A G, FREIRE M D G A, et al. Characterization of a Kunitz trypsin inhibitor with a single disulf i de bridge from seeds of Inga laurina (SW.) Willd[J]. Phytochemistry, 2007, 68(8)： 1104-1111. DOI：10.1016/j.phytochem.2007.01.024.

[21] BATISTA I F C, NONATO M C, BONFADINI M R, et al. Preliminary crystallographic studies of EcTI, a serine proteinase inhibitor from Enterolobium contortisiliquum seeds[J]. Acta Crystallographica, 2001, 57(4)： 602-604. DOI：10.1107/S0907444901001810.

[22] 何建川, 邵阳, 张波. 蛋白质和变性蛋白质二级结构的FTIR分析进展[J]. 化学研究与应用, 2012, 24(8)： 1176-1180. DOI：10.3969/ j.issn.1004-1656.2012.08.002.

[23] 张秋会, 黄现青, 李苗云, 等. 傅里叶红外光谱法研究肌肉蛋白质的二级结构[J]. 食品与发酵工业, 2015, 41(10)： 247-251. DOI：10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201510045.

[24] 黄惠华, 粱汉华, 郭乾初. 两种大豆胰蛋白酶抑制剂的抑制活性及二级结构分析比较[J]. 食品科学, 2005, 26(3)： 46-49. DOI：10.3321/ j.issn：1002-6630.2005.03.005.

[25] ASGHARE, AMIR K, NORTON, et al. Interfacial and foaming characterisation of mixed protein-starch particle systems for food-foam applications[J]. Food Hydrocolloids, 2016, 53： 311-319. DOI：10.1016/ j.foodhyd.2015.09.007.

[26] WAN Zhili, YANG Xiaoquan, SAGIS L M. Non-linear surface dilatational rheology and foaming behavior of protein and protein fi brillar aggregates in the presence of natural surfactan[J]. Langmuir, 2016, 32(15)： 3679-3690. DOI：10.1021/acs.langmuir.6b00446.

[27] CAO Chong, ZHANG Lu, ZHANG Xiaoxi, et al. Effect of gum arabic on the surface tension and surface dilational rheology of trisiloxane surfactant[J]. Food Hydrocolloids, 2013, 30(1)： 456-462. DOI：10.1016/ j.foodhyd.2012.07.006.

[28] WAN Zhili, WANG Liying, WANG Jinmei, et al. Synergistic interfacial properties of soy protein-stevioside mixtures： relationship to emulsion stability[J]. Food Hydrocolloids, 2014, 39(39)： 127-135. DOI：10.1016/j.foodhyd.2014.01.007.

[29] TAMM F, SAUER G, SCAMPICCHIO M, et al. Pendant drop tensiometry for the evaluation of the foaming properties of milkderived proteins[J]. Food Hydrocolloids, 2012, 27(2)： 371-377. DOI：10.1016/j.foodhyd.2011.10.01.

[30] SORGENTINI D A, WAGNER J R. Comparative study of foaming properties of whey and isolate soybean proteins[J]. Food Research International, 2002, 35(8)： 721-729. DOI：10.1016/S0963-9969(02)00067-4.

Preparation and Properties of Soybean Trypsin Inhibitor

CHENG Fenfen, LIU Chun, YANG Xiaoquan*
(Research and Development Center of Food Proteins, College of Food Science and Engineering, South China University of Technology, Guangzhou 510640, China)

Sodium sulfate salting out was employed to selectively recover soybean trypsin inhibitor (STI) from soybean whey waste. The recovery conditions were optimized, and the physicochemical and interfacial properties of STI were evaluated. The results indicated that the yield of STI was 20.54% under optimal conditions： concentration of soybean whey to a solid content of 13%, adjustment to pH 4, and addition of 9 g/100 mL sodium sulfate. The main component of STI was Kunitz trypsin inhibitor (KTI, 20.1 kD) as indicated by SDS-PAGE analysis. The trypsin inhibitor activity towards Nα-benzoyl-DL-arginine 4-nitroanilide hydrochloride (BAPNA) of STI was 2 135.00 TIU/mg at pH 7. It was stable in a broad pH range from 2.0 to 11.0 and at a temperature up to 80 ℃. The inhibitory activity (73.19%) was still maintained at a high level after heating at 80 ℃ for 30 min. The FTIR and CD spectra showed that the structure of STI was highly similar to that of the commercial KTI (Sigma T9128). The dynamic surface tension and surface dilatational parameters of STI showed that the STI molecules could be quickly adsorbed to the interface to form a high elastic network and hence favorable foaming capacity and foaming stability. These fi ndings suggest that the salting out method could be used as an effective strategy to prepare high-purity STI from soybean whey, and STI would emerge as a promising molecule for functional foods and medical applications because it exhibits excellent temperature and pH stability and high bioactivity.

soybean whey wastewater; salting out method; trypsin inhibitor; physicochemical properties; interfacial properties

10.7506/spkx1002-6630-201703007

S565.1

A

1002-6630（2017）03-0037-08

程芬芬, 刘春, 杨晓泉. 大豆胰蛋白酶抑制剂的制备及性质[J]. 食品科学, 2017, 38(3)： 37-44. DOI：10.7506/spkx1002-6630-201703007. http：//www.spkx.net.cn

CHENG Fenfen, LIU Chun, YANG Xiaoquan. Preparation and properties of soybean trypsin inhibitor[J]. Food Science, 2017, 38(3)： 37-44. (in Chinese with English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201703007. http：//www.spkx.net.cn

2016-03-24

国家高技术研究发展计划（863计划）项目（2013AA102208-3）；公益性行业（农业）科研专项（201303071）；粮食公益性行业科研专项（201313005）

程芬芬（1990—），女，硕士，研究方向为蛋白质化学与工程。E-mail：251015021@qq.com

*通信作者：杨晓泉（1965—），男，教授，博士，研究方向为蛋白质化学与工程。E-mail：fexqyang@scut.edu.cn