甘肃不同产地黄管秦艽药材质量灰色关联分析评价

汪洁，朱顺娟，樊秦，杨丽，夏鹏飞，王引权，赵磊，，5

1.甘肃中医药大学，甘肃 兰州 730000；2.甘肃省高校中（藏）药化学与质量研究省级重点实验室，甘肃 兰州 730000；3.甘肃省中药药理与毒理学重点实验室，甘肃 兰州 730000；4.西北中藏药协同创新中心，甘肃 兰州 730000；5.甘肃省中药质量与标准研究重点实验室培育基地，甘肃 兰州 730000

甘肃不同产地黄管秦艽药材质量灰色关联分析评价

汪洁1，朱顺娟1，樊秦2，杨丽1，夏鹏飞3，王引权4，赵磊1，2，5

1.甘肃中医药大学，甘肃 兰州 730000；2.甘肃省高校中（藏）药化学与质量研究省级重点实验室，甘肃 兰州 730000；3.甘肃省中药药理与毒理学重点实验室，甘肃 兰州 730000；4.西北中藏药协同创新中心，甘肃 兰州 730000；5.甘肃省中药质量与标准研究重点实验室培育基地，甘肃 兰州 730000

目的建立甘肃不同产地黄管秦艽药材的灰色关联度模型，并进行质量评价。方法以甘肃10个产地黄管秦艽为研究对象，测定龙胆苦苷、总环烯醚萜苷类、醇浸出物、总灰分、酸不溶性灰分含量，采用灰色关联度法构建黄管秦艽质量的灰色关联度评价模型。结果10个不同产地黄管秦艽样品的相对关联度在0.394～0.652之间。其中相对关联度＞0.50的样品有6个产地，其样品质量评价较高，其余产地药材质量评价较低（相对关联度＜0.50）。卓尼县柳林乡观景台产地黄管秦艽的指标相对关联度最大（0.652），质量评价最优；漳县三岔镇狼王沟产地黄管秦艽的指标相对关联度最小（0.394），质量评价最差。结论灰色关联度分析法及模型可应用于黄管秦艽药材的质量评价，本研究结果可为黄管秦艽的开发利用提供一定的试验基础。

黄管秦艽；灰色关联度法；质量评价

2015年版《中华人民共和国药典》规定，秦艽为龙胆科龙胆属多年生草本植物秦艽Gentiana macrophylla Pall.、麻花秦艽Gentiana straminea Maxim.、粗茎秦艽Gentiana crassicaulis Duthie ex Burk.和小秦艽Gentiana dahurica Fisch.的干燥根[1]。秦艽始载于《神农本草经》：“主寒热邪气，寒湿风痹，肢节痛、下水、利小便。”其味辛、苦，性平，归胃、肝、胆经，可祛风湿、舒筋络、退虚热、清肝胆湿热而退黄，用于风湿痹痛、骨蒸潮热、骨节酸痛、筋脉拘挛、湿热黄疸等症[2]。甘肃为秦艽的道地产区，早在1987年秦艽被国家列为濒危三级保护物种[3]。非药典品种黄管秦艽其药材性状、根部横切面、显微特征结构均与秦艽相似，黄管秦艽与秦艽在ITS水平上为一类，同源性达99.5%[4]。黄管秦艽在甘肃分布广泛，易栽易活，种植规模较大，其龙胆苦苷含量高达8.05%[5]，明显高于药典品种。因此，开发和利用黄管秦艽对保护秦艽资源具有重要的应用价值和理论意义。总环烯醚萜苷是龙胆科植物特有的主要有效成分与苦味成分，龙胆苦苷是单萜类化合物，是秦艽的主要有效成分，药效学研究表明，龙胆苦苷具有抗炎镇痛、保肝利胆、健胃、抗肿瘤、抗氧化及降低血压等药理作用[6]。灰分、浸出物含量也可在一定程度上反映药材的质量。

灰色系统既包括已知信息又包括未知信息，意图透过一定的方法去寻求系统中各子系统（或因素）之间的数值关系[7]。灰色关联度分析是灰色系统理论的基本内容，为一个系统的发展变化态势提供了量化的度量，基于“中药成分与中药质量是一种灰色关系”的认识，因此可运用灰色关联度分析法来评价药材质量[8]。为客观有效地评价甘肃不同产地黄管秦艽的质量，本研究以甘肃10个产地的黄管秦艽为研究对象，对药材中龙胆苦苷、总环烯醚萜苷类、醇浸出物、总灰分、酸不溶性灰分进行测定，构建不同产地黄管秦艽质量的灰色关联度分析，为该药材的质量评价提供参考依据。

1 仪器与试药

Agilent 1100系列高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；C18柱（Thermo scientific）；BS110S型电子天平（万分之一，德国赛多利斯集团）；Sartorius BT 125D型电子天平（十万分之一，德国赛多利斯集团）；KH-500DE型超声波清洗仪（昆山禾创超声仪器有限公司）；YK-400B型粉碎机（山东省青州市益康中药机械有限公司）；HH-601型水浴锅（金坛市恒丰仪器厂）；C型气流烘干器（上海豫康科教仪器设备有限公司）；三号筛（上海东方药品科技实业有限公司）；滤纸（杭州特种纸业有限公司）；甲醇为色谱纯；盐酸、氯化银、乙醇为分析纯。

10批黄管秦艽采自甘肃不同产地，经甘肃中医药大学晋玲教授鉴定为Gentiana officinalis H.Smith.的干燥根，样品来源见表1。

表1 甘肃10个不同产地黄管秦艽样品来源信息

2 方法与结果

2.1 指标性成分含量测定

2.1.1 醇浸出物 按2015年版《中华人民共和国药典》醇溶性浸出物测定法（附录Ⅹ A）项下热浸法测定。

2.1.2 总灰分和酸不溶性灰分 按2015年版《中华人民共和国药典》附录Ⅸ K规定进行测定。

2.1.3 龙胆苦苷

2.1.3.1 色谱条件 Thermo C18色谱柱（4.6 mm× 250 mm，5 μm），流动相为甲醇-水（25∶75），流速1.0 mL/min，检测波长274 nm。色谱图见图1、图2。

图2 甘肃10个不同产地黄管秦艽样品HPLC图

2.1.3.2 对照品溶液的制备 精密称定20.43 mg龙胆苦苷对照品，用甲醇溶解并定容于10 mL容量瓶中，摇匀，即得每1 mL含2.043 mg龙胆苦苷的对照品溶液。

2.1.3.3 供试品溶液的制备 精密称定0.5 g黄管秦艽粉末，置于具塞锥形瓶中，精密加入100 mL甲醇，超声处理（功率500 W，频率40 kHz）30 min，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，过滤，取续滤液，即得。

2.1.3.4 标准曲线的制备 精密吸取上述对照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL于5 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，混匀，分别吸取上述各溶液10 μL进样测定，记录峰面积，以进样浓度（mg/mL）为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归，绘制标准曲线，计算得回归方程Y＝11 338X＋31.71（r＝0.999 9），结果表明龙胆苦苷在0.20～1.02 mg/mL范围内线性关系良好。

2.1.3.5 样品含量测定 取不同产地黄管秦艽样品，按“2.1.3.3”项下方法制备，在“2.1.3.1”项色谱条件下进样测定，结果见表2。

表2 甘肃10个产地黄管秦艽中龙胆苦苷含量测定结果（n＝3）

2.1.4 环烯醚萜苷

2.1.4.1 对照品溶液的制备 精密称取龙胆苦苷对照品0.010 5 g，用80%乙醇溶解并定容至100 mL容量瓶中，摇匀，即得。

2.1.4.2 供试品溶液的制备 精密称定黄管秦艽药材粉末5.0 g于圆底烧瓶中，精密加入100 mL蒸馏水，回流提取1 h，抽滤，滤液定容至100 mL，作为上样液。精密量取上样液35 mL，过大孔吸附树脂柱，反复上样至水提液无色。30%乙醇洗脱，至洗脱液无色。洗脱液用30%乙醇溶液定容至250 mL。精密量取洗脱液1 mL，用30%乙醇定容至10 mL容量瓶中，即得。

2.1.4.3 标准曲线的制备 精密吸取上述对照品溶液1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mL于10 mL容量瓶中，加80%乙醇定容至刻度，采用一阶导数于266.00 nm处测定吸光度（见图3、图4），以浓度对吸光度作回归曲线，计算得回归方程Y＝0.284 2X＋0.000 3，r＝0.998 9，结果表明龙胆苦苷在0.010 5～0.036 8 mg/mL范围内线性关系良好。

2.1.4.4 样品含量测定 取对照品溶液和供试品溶液进行紫外全波长扫描。样品及对照品吸收曲线作一阶导数处理，供试品溶液和对照品溶液在266 nm处均有最大吸收，峰型较好。因此采用一阶导数分光光度法测定样品中环烯醚萜苷含量，结果见表3。

图3 黄管秦艽中龙胆苦苷紫外吸收图

图4 黄管秦艽中龙胆苦苷紫外吸收一阶导数图

表3 甘肃10个产地黄管秦艽中环烯醚萜苷含量测定结果（n＝3）

2.2 灰色关联度法的建立

2.2.1 参考序列的选择 设有m个药材样品，每个药材样品有n项评价指标，则可组成评价单元序列{Xak}（a＝1，2，3……m；k＝1，2，3……n；本研究中m＝10，n＝5）[9]。在质量评价角度分析，醇浸出物、龙胆苦苷、总环烯醚萜苷类含量越高质量越好，灰分、酸不溶性灰分含量越低质量越好。为了统一评价标准，采用将低样品对应优指标高优化的方法[10]。用灰色关联度作为评价测度时，试验将总灰分和酸不溶性灰分含量进行取倒数转换。评价指标统一后，设最优参考序列的各项指标是n个指标的最大值，记为{Xsk}＝max{1≤s≤m}{Xik}，最差参考序列的各项指标是m个样品对应指标的最小值，记为{Xtk}＝min {l≤t≤m}{Xik}[9]。

2.2.2 原始识别数据标准化处理 如果原始数据量纲不统一，则需要对其原始数据进行变换处理。通常以均值化变换最常用，公式为Yik＝Xik/Yk（Yik为规格化处理后的数据，Xik为原始数据，Yk为第m个样品的第k个指标的均值）[11]。

2.2.3 关联系数的计算 相对于最优参考序列和最差参考序列的关联系数分别按公式（1）、（2）计算[12]。

2.2.4 关联度的计算 相对于最优参考序列和最差参考序列的关联度分别按公式（3）、（4）计算[12]。

2.2.5 相对关联度的计算 如果评价单元与最优参考序列ri(s)关联程度最大而同时与最差参考序列ri(t)的关联程度最小，则说明所评价的序列越理想，为最佳评价单元。由此将评价单元序列同时相对于最优参考序列和最差参考序列的相对关联度r定义为ri＝ri(s)/（ri(s)＋ri(t)），（i＝1，2，……n），根据相对关联度的大小对评价单元序列进行排序，最终得到评价结果[12]。

3 质量评价灰色关联度模式的建立

3.1 样品数据的建立

测定不同产地黄管秦艽药材的醇浸出物、龙胆苦苷、总环烯醚萜苷类，总灰分和酸不溶性灰分含量5个主要评价指标，计算各成分的百分含量，建立评价黄管秦艽药材质量的灰色模式识别数据集，见表4。

表4 甘肃10个不同产地黄管秦艽指标性成分含量（%）

3.2 数据标准化

将原始数据集按照公式Yik＝Xik/Yk进行标准化处理，结果见表5。

表5 甘肃10个不同产地黄管秦艽原始数据标准化处理结果

3.3 关联系数与关联度的计算

分别由公式（1）、（2）、（3）、（4）计算各评价单元相对于最优、最差参考序列的关联系数及关联度ri(s)、ri(t)，结果见表6、表7。

表6 评价单元序列相对于最优参考序列的关联系数

表7 评价单元序列相对于最差参考序列的关联系数

3.4 计算相对关联度

由公式计算黄管秦艽样品的相对关联度，按照ri的大小进行排序，得出不同产地黄管秦艽的质量名次，见表8。

表8 黄管秦艽样品相对关联度质量排序

3.5 黄管秦艽药材质量评价

相对关联度ri越大，该产地黄管秦艽的质量评价越高[13]，10批样品的相对关联度在0.394～0.652之间。其中相对关联度＞0.50的有6个产地，其药材质量评价较高；其余产地样品的相对关联度＜0.50，质量评价较低。各样品产地质量评价为HGQJ5＞HGQJ2＞HGQJ8＞HGQJ7＞HGQJ9＞HGQJ3＞HGQJ6＞HGQJ10＞HGQJ4＞HGQJ1，卓尼县柳林乡观景台产地的黄管秦艽中指标相对关联度最大（0.652）、质量评价最优，其次为临潭县新城镇刘旗村样品（0.649），漳县三岔镇狼王沟样品相对关联度最小（0.394）、质量评价较差。

4 讨论

本研究在测定黄管秦艽中醇浸出物、龙胆苦苷、总环烯醚萜苷类、总灰分和酸不溶性灰分含量的基础上对甘肃不同产地黄管秦艽质量进行了评价。醇浸出物含量测定按照药典采用热浸法测定，甘肃10个不同产地黄管秦艽药材醇浸出物含量在29.24%～41.49%之间，均高于药典中关于秦艽醇浸出物含量的规定；龙胆苦苷含量参照文献[5]方法进行测定：[HPLC采用Thermo C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动为相甲醇-水（25∶75），流速1.0 mL/min，检测波长274 nm]，不同产地黄管秦艽药材中龙胆苦苷含量均高于药典规定的秦艽中龙胆苦苷的含量（含龙胆苦苷和马钱苷酸的总量不得少于2.5%）；水提液中总环烯醚萜苷类的含量测定参照文献[14]采用一阶导数于266 nm处测定吸光度，以浓度对吸光度作回归曲线，计算其含量；总灰分和酸不溶性灰分部分产地含量高于药典规定的秦艽总灰分、酸不溶性灰分含量。

目前，显微模式识别、化学指纹图谱、化学计量法等方法用于药材质量的评价[15-17]。灰色关联度分析是灰色系统理论的基本内容，本研究基于“中药成分与中药质量是一种灰色关系”的认识，建立了评价黄管秦艽质量的灰色关联度分析模型。灰色关联度评价法作为合理评价不同来源的中药的有效手段，可用于研究多成分之间互相影响、互相制约的问题[18]。因此，本研究以黄管秦艽中醇浸出物、龙胆苦苷、环烯醚萜苷、总灰分倒数、酸不溶性灰分倒数为评价指标，计算相对关联度，对不同产地黄管秦艽质量进行了评价，比较客观地体现了黄管秦艽的内在质量，可为黄管秦艽的质量评价提供新思路。

黄管秦艽为甘肃药材资源，其分布广泛，且黄管秦艽为药典规定秦艽的近缘种，本试验结果可为新资源的开发利用提供一定的基础。

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Quality Evaluation of Gentiana officinalis H.Smith. from Different Producing Areas of Gansu Province by Grey Incidence Degree Method

WANG Jie1, ZHU Shun-juan1, FAN Qin2, YANG Li1,XIA Peng-fei3, WANG Yin-quan4, ZHAO Lei1,2,5
(1. Gansu University of Chinese Medicine, Lanzhou 730000, China; 2. Key Laboratory for Traditional Chinese (Tibetan) Medicine Chemistry and Quality Control of Gansu University, Lanzhou 730000, China; 3. Key Laboratory of Pharmacology and Toxicology of TCM of Gansu Province, Lanzhou 730000, China; 4. Northwest Collaborative Innovation Center for Chinese Medicine, Lanzhou 730000, China; 5. Cultivation Base for Key Laboratory of Chinese Medicine Quality and Standard of Gansu Province, Lanzhou 730000, China)

ObjectiveTo establish the degree of gray incidence model of Gentiana officinalis H.Smith. from differenct producing areas of Gansu Province and conduct quality evaluation.MethodsTen samples of Gentiana officinalis H.Smith. from different producing areas in Gansu Province were collected and the gentiopicroside, total iridoid gycoside, extractives, total ash, acid-insoluble ash content of Gentiana officinalis H.Smith were tested. The quality evaluation of grey incidence model of Gentiana officinalis H.Smith. was established by grey incidence model.ResultsThe relative correlation degrees of all evaluation items were in the range of 0.394–0.652. Among them, the relative correlation degree of samples from 6 producint areas were greater than 0.50, which had high quality evaluation. The relative correlation degrees of the rest samples from other producing areas were less than 0.50, which had low quality evaluation. The sample of Gentiana officinalis H.Smith. from Zhuoni County Liulin Township Observatory had the most highly correlated with the optimal reference sequence (0.652) and so the best in quality; The sample of Gentiana officinalis H.Smith. from Zhang County Sancha Town Langwang Ditch had the most lowly correlated with the optimal reference sequence (0.394) and so the worst in quality.ConclusionThis method and quality evaluation model can be used for the quality evaluation for Gentiana officinalis H.Smith., which can provide acertain experimental basis for the development and utilization of new resources.

Gentiana officinalis H.Smith.; grey incidence degree method; quality evaluation

10.3969/j.issn.1005-5304.2017.03.017

R284.1

A

1005-5304(2017)03-0069-06

2016-04-29）

（

2016-06-20；编辑：陈静）

国家自然科学基金（81660577）；甘肃省属高校基本科研业务费专项基金（2011-06）；甘肃省中药药理与毒理学重点实验室自主基金项目（ZDSYS-ZZ-2015-001）；西北中藏药协同创新中心重点项目（2015-05）；甘肃中医学院中青年科研基金项目（ZQ-2014-2）

赵磊，E-mail：zzyhx@gszy.edu.cn