金雀异黄素对脂多糖诱导人肺泡上皮细胞A549炎症及凋亡的影响

王玲，刘辉国

1.武汉大学医院，湖北 武汉 430071；2.华中科技大学同济医学院附属同济医院，湖北 武汉 430030

金雀异黄素对脂多糖诱导人肺泡上皮细胞A549炎症及凋亡的影响

王玲1，刘辉国2

1.武汉大学医院，湖北 武汉 430071；2.华中科技大学同济医学院附属同济医院，湖北 武汉 430030

目的观察金雀异黄素对脂多糖（LPS）诱导人肺泡上皮细胞A549发生炎症与凋亡的影响，探讨其改善肺损伤的作用机制。方法CCK-8法检测不同浓度金雀异黄素和/或LPS干预细胞12 h后的活力；RT-PCR检测金雀异黄素对LPS诱导的炎性因子白细胞介素（IL）-1β、IL-6、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的表达；TUNEL法检测细胞凋亡；Western blot检测信号通路的变化。结果金雀异黄素（1、5、10 μmol/L）对细胞活力无明显影响，LPS（1 μg/mL）可显著降低细胞活力，而金雀异黄素与LPS共同干预则细胞活力呈浓度依赖性升高；RT-PCR结果显示，LPS可显著提高炎性因子的基因表达，而金雀异黄素则可呈浓度依赖和时间依赖抑制其表达；TUNEL染色结果显示，金雀异黄素（10 μmol/L）与LPS联合干预12 h可显著减少LPS诱导的细胞凋亡；Western blot结果显示，金雀异黄素（10 μmol/L）与LPS（1 μg/mL）协同刺激A549细胞30 min可显著抑制LPS诱导的IκBα、p65信号通路的磷酸化水平。结论金雀异黄素可抑制LPS诱导的人肺泡上皮细胞发生炎症和凋亡，从而发挥保护作用。

金雀异黄素；急性肺损伤；A549细胞；炎症；细胞凋亡

急性肺损伤（acute lung injury，ALI）的死亡率较高，其主要特点为中性粒细胞的聚集、间质水肿、肺泡上皮细胞完整性破坏及大量炎性因子的产生[1]。虽然近些年来对ALI的发病机制研究已经有了长足进步，但目前的治疗并未降低ALI患者死亡率及增加幸存者生活质量[2]。脂多糖（LPS）为革兰阴性细菌细胞壁的组成成分，可诱导炎性反应继而导致免疫功能障碍[3]。LPS气管内给药可造成严重肺损伤模型，近年来已经成为共识[4]。因此，我们采用LPS体外干预肺泡上皮细胞模拟肺损伤模型。核因子-κB（NF-κB）在调控炎症反应过程中发挥关键作用[5]。多项研究表明，NF-κB信号通路在肺部损伤疾病中发挥重要调控作用，其诱导的细胞因子如白细胞介素（IL）-1β、IL-6、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）在ALI的发病过程中发挥关键作用[6]。

金雀异黄素（genistein，GEN）是一种存在于豆科植物和齿状植物中的天然异黄酮化合物，研究表明，其具有抗癌、抗炎、抗氧化等作用[7-8]，但其是否影响ALI中肺泡上皮细胞的炎性反应尚未见报道。本实验观察GEN对肺泡Ⅱ型上皮细胞在LPS诱导下发生上皮损伤的影响，探讨其改善ALI的作用机制。

1 实验材料

1.1 药物及制备

GEN，上海融禾医药科技发展有限公司，货号446-72-0，纯度＞98%。取2.7 mgGEN溶于1 mL二甲基亚砜（DMSO）中配制实验所用的母液。

1.2 细胞

A549人肺泡Ⅱ型上皮细胞株，中国科学院上海细胞库，细胞培养和干预刺激均在独立的细胞房中进行，置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养，待细胞生长达次融合状态时0.25%胰蛋白酶消化，根据实验需要接种于不同的培养皿中。分组诱导前以无血清培养基饥饿24 h，以减少血清对刺激因素的影响。

1.3 主要试剂与仪器

高糖DMEM basic（1×）培养基、新生小牛血清（New born serum，NBS）、胰酶，Gibco公司；CCK-8试剂盒，日本同仁化学研究所；LPS，Sigma公司；RT-PCR试剂盒，Roche公司；p-IκBα、p-p65、IκBα、p65、GAPDH（Rabbit IgG），Cell Signaling Technology公司。多功能微孔板检测系统Synergy HT（美国BioTek公司），紫外分光光度计NANODROP 2000c（Thermo scientific），实时定量PCR仪Light Lycler 480（Roche公司），RT反转录仪Veriti 96 well Thermal Lycler（Applied Biosystems公司），倒置相差显微镜（日本OLYMPUS），恒温培养箱（日本SANYO公司）。

2 实验方法

2.1 细胞处理和分组

待A549细胞贴壁生长密度达80%时，弃去培养基，PBS清洗，加入饥饿液，置于温箱8 h后置换为含有LPS（1 μg/mL）的饥饿液，重新置于温箱中培养，收取蛋白质和RNA样本。实验分为对照组、LPS组、LPS＋GEN 1 μmol/L组、LPS＋GEN 5 μmol/L组、LPS＋GEN 10 μmol/L组和GEN 10 μmol/L组。

2.2 CCK-8法检测细胞活力

细胞被接种至96孔板，每孔100 μL，密度大约为2×105个/mL，置于温箱继续培养24 h，将培养基更换为无血清的培养基饥饿24 h，采用不同处理因素干预72 h后，将96孔板中培养基换为含10 μL CCK-8的无血清培养基100 μL，温箱中孵育2～2.5 h后于酶标仪波长450 nm处进行测定。

2.3 Western blot检测信号通路磷酸化水平

冰上裂解细胞10 min，置于1.5 mL离心管中，超声裂解仪5 kHz裂解10～15 s，4 ℃、12 000 r/min离心15 min，上清液移至离心管中，BCA定量检测蛋白浓度并将蛋白浓度调整一致后置于煮沸仪上将其变性。每组样本混匀后取10 μL行10%SDS-PAGE凝胶电泳，检测内参指标GAPDH，根据各样本的光密度值调整上样剂量，使其与GAPDH的光密度值保持一致，后每组以校正后的上样剂量进行凝胶电泳，将蛋白以100 V、90 min移至PVDF膜上，用一抗封闭液封闭12 h，一抗包括p-IκBα、p-p65、IκBα、p65，再用TBST洗3次，将其放入对应的加有二抗的稀释液中避光孵育1 h，二抗为Alexa Fluor®488 goat anti-Rabbit IgG，再用TBST洗3次，放入荧光检测仪中，检测目的条带，应用Odyssey图像分析软件检测各组蛋白的光密度值，作为蛋白表达水平。

2.4 RT-PCR检测炎性因子基因表达

细胞以不同因素处理后，弃去培养基，以Trizol法提取细胞总RNA，采用紫外分光光度法测定其含量与纯度。根据样本所测浓度，取适当剂量，将各样本浓度调整一致后反转录为cDNA。以GAPDH为内参照，采用20 μL体系进行PCR扩增。反应条件为：94 ℃、2 min，1个循环，94 ℃、40 s，25～35个循环，50～65 ℃、40 s，72 ℃、1 min，72 ℃、5 min，1个循环。引物序列见表1。

表1 RT-PCR引物序列

2.5 TUNEL染色检测细胞凋亡

将细胞接种至爬片上，调整密度为1×105个/mL，饥饿18 h，加入不同干预因素处理细胞12 h，PBS洗3次，1%多聚甲醛固定10 min，再用乙醇/乙酸2∶1混合液-20 ℃固定5 min，PBS清洗3 min。加入平衡液室温孵育10 s后滴加TdT酶工作液，37 ℃孵育1 h。加入工作液，振荡15 s后孵育10 min，PBS洗3次，吸干液体，滴加Anti-Digoxigenin Fluorescein工作液，避光孵育30 min，PBS再洗3次，DAPI封片，镜下观察拍照。正常细胞核被染为蓝色，凋亡细胞核被染为绿色，每组随机选择8个视野，计算细胞凋亡率（凋亡细胞数÷细胞总数×100%），取其平均值。

3 统计学方法

4 结果

4.1 金雀异黄素对A549细胞活力的影响

与对照组比较，GEN（1、5、10 μmol/L）单独干预A549细胞对其活力无影响；GEN（1、5、10 μmol/L）与LPS同时干预A549细胞则细胞活力明显升高（P＜0.05，P＜0.01）。结果见表2。

表2 各组A549细胞GEN和/或LPS不同浓度干预细胞活力比较（s）

表2 各组A549细胞GEN和/或LPS不同浓度干预细胞活力比较（s）

注：与对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

组别 n 0 μmol/L 1 μmol/L 5 μmol/L10 μmol/L GEN组 5 1.0±0.1 1.0±0.1 1.0±0.11.0±0.1 LPS＋GEN组 5 0.7±0.1 0.8±0.1*0.8±0.1*0.9±0.1**对照组 5 1.0±0.1 1.0±0.1 1.0±0.11.0±0.1

4.2 金雀异黄素对脂多糖诱导A549细胞炎性因子的影响

与对照组比较，LPS（1 μg/mL）处理12 h后A549细胞炎性因子IL-1β、IL-6及TNF-α基因表达显著增加（P＜0.01）；GEN（1、5、10 μmol/L）与LPS同时干预炎性因子基因表达较LPS组显著降低（P＜0.05，P＜0.01），且呈浓度依赖性；GEN（10 μmol/L）单独干预A549细胞则对炎性因子的基因表达无影响。结果见表3。

表3 各组A549细胞炎性因子基因表达比较（±s）

表3 各组A549细胞炎性因子基因表达比较（±s）

注：与对照组比较，**P＜0.01；与LPS组比较，#P＜0.05，##P＜0.01

组别 n剂量/（μmol/L）IL-1β IL-6 TNF-α对照组 9 1.0±0.1 1.0±0.11.0±0.1 LPS组 9 15.2±2.6**11.3±1.5**9.5±1.0**LPS＋GEN组 9 1 12.5±2.4#8.6±1.1##7.8±1.1#LPS＋GEN组 9 5 8.3±1.6##6.8±0.9##4.6±0.6##LPS＋GEN组 9 10 4.3±0.9##3.5±0.1##2.5±0.4##GEN组 9 10 1.1±0.1 1.0±0.90.9±0.1

与对照组比较，LPS干预3、6、12 h后A549细胞炎性因子IL-1β、IL-6和TNF-α基因表达明显升高（P＜0.01）；GEN（10 μmol/L）与LPS同时干预炎性因子mRNA表达较LPS组显著降低（P＜0.01）。结果见表4。

表4 各组A549细胞不同时点炎性因子基因表达比较（±s，n＝9）

表4 各组A549细胞不同时点炎性因子基因表达比较（±s，n＝9）

注：与对照组比较，**P＜0.01；与LPS组比较，##P＜0.01

指标0 h 3 h 6 h 12 h对照组 LPS组 LPS＋GEN组 对照组 LPS组LPS＋GEN组 对照组LPS组 LPS＋GEN组 对照组 LPS组 LPS＋GEN组IL-1β 1.0±0.1 1.0±0.1 1.0±0.1 1.0±0.1 4.8±0.7**3.2±0.4##1.0±0.110.6±1.8**6.3±0.9##1.0±0.1 15.0±2.6**4.3±0.9##IL-6 1.0±0.1 1.0±0.8 1.0±0.8 1.0±0.1 3.4±0.7**2.5±0.6##1.0±0.1 7.9±1.1**3.6±0.7##1.0±0.1 11.3±1.5**3.5±0.6##TNF-α 1.0±0.1 1.0±0.1 1.0±0.1 1.0±0.1 4.2±0.7**2.5±0.4##1.0±0.1 8.3±1.6**3.6±0.2##1.0±0.1 11.2±1.9**3.0±0.6##

4.3 金雀异黄素对脂多糖诱导A549细胞凋亡的影响

与对照组比较，LPS（1 μg/mL）干预细胞12 h后凋亡率为42.3%，GEN（10 μmol/L）与LPS同时干预A549细胞后凋亡率降为13.6%，GEN（10 μmol/L）单独干预A549细胞对细胞凋亡无影响。结果见图1。

图1 各组A549细胞凋亡形态

4.4 金雀异黄素对脂多糖诱导A549细胞IκBα、p65信号通路磷酸化水平的影响

GEN（10 μmol/L）与LPS（1 μg/mL）协同刺激A549细胞30 min可显著抑制LPS诱导IκBα、p65信号通路的磷酸化水平（P＜0.01），GEN（10 μmol/L）单独干预A549细胞对以上信号通路则无影响。结果见图2、表5。

图2 各组A549细胞信号通路蛋白表达免疫印迹图

表5 各组A549细胞IκBα、p65信号通路磷酸化水平比较（±s，OD值）

表5 各组A549细胞IκBα、p65信号通路磷酸化水平比较（±s，OD值）

注：与LPS组比较，##P＜0.01

组别 n 剂量/（μmol/L） p-IκBα p-p65对照组 3 1.0±0.1 1.0±0.1 LPS组 3 2.1±0.2 2.3±0.2 LPS＋GEN组 3 10 1.2±0.1##1.2±0.1##GEN组 3 10 1.0±0.1 1.0±0.1

5 讨论

本研究结果显示：LPS连续刺激A549细胞12 h可诱导其产生大量炎性因子且细胞凋亡率上升；RT-PCR结果提示，GEN可呈浓度依赖性及时间依赖性逆转炎性因子的上调；TUNEL染色结果提示，其亦可降低细胞凋亡率。Western blot检测结果显示，GEN可能是通过抑制NF-κB信号通路中的IκBα及p65的磷酸化而发挥保护作用。

有研究显示，GEN在急性和慢性炎症中均可发挥显著调控作用，作用靶点是通过抑制NF-κB及STAT信号通路的活化[9]。冯赞杰等[10]研究显示，GEN可抑制人血管平滑肌细胞中NF-κB的激活从而发挥抗动脉粥样硬化的作用，其亦可抑制大鼠关节炎滑膜细胞中IL-1β、TNF-α等炎症因子的产生。本实验选择GEN对ALI的体外细胞模型进行干预，通过预实验结果选择了3个药物浓度（1、5、10 μmol/L）来进行实验。

天然免疫在机体预防病原体侵袭发挥首当其冲的作用，LPS与之细胞膜上对应的Toll样受体相结合后可触发天然免疫反应，NF-κB信号通路的活化需要κB（IκBα和IκBβ）的磷酸化与降解。NF-κB主要由2个亚基（p65和p50）组成。IκBα与p65在细胞质中相结合，抑制NF-κB的细胞核转位，一旦NF-κB入核，其可调控细胞核转录细胞因子如IL-1β、IL-6、TNF-α及COX-2等。此外，LPS可增加细胞内活性氧的产生，增加线粒体膜电位的通透性，继而诱发内源性凋亡通路Caspase9的激活，细胞本身产生的TNF-α亦可作用于细胞膜，诱导外源性凋亡通路Caspase8的活化，2组凋亡通路均可通过Caspase3的活化而诱导细胞凋亡。本实验结果显示，GEN可显著抑制IκBα及p65的磷酸化水平，抑制NF-κB的核转位，其下游的炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α的mRNA水平均被GEN所抑制，TUNEL染色提示LPS诱导的细胞凋亡也明显减少。因此，我们认为GEN可能通过抑制IκBα及p65的磷酸化从而发挥抗细胞炎症及凋亡的作用。

综上，GEN可抑制LPS诱导肺泡Ⅱ型上皮细胞发生炎症与凋亡，为下一步动物在体研究提供了一定基础，但本研究对信号通路的具体机制阐述尚不明确，对线粒体膜电位及活性氧的产生亦未能明确，有待进一步实验，以明确GEN的具体作用机制。

[1] LEE C Y, YANG J J, LEE S S, et al. Protective effect of Ginkgo biloba leaves extract, EGb761, on endotoxin-induced acute lung injury via a JNK- and Akt-dependent NFκB pathway[J]. J Agric Food Chem,2014,62(27)：6337-6344.

[2] XIE X, SUN S, ZHONG W, et al. Zingerone attenuates lipopolysaccharide-induced acute lung injury in mice[J]. Int Immunopharmacol,2014,19(1)：103-109.

[3] LOU T, JIANG W, XU D, et al. Inhibitory effects of polydatin on lipopolysaccharide-stimulated RAW 264.7 cells[J]. Inflammation, 2015,38(3)：1213-1220.

[4] TAO W, SU Q, WANG H, et al. Platycodin D attenuates acute lung injury by suppressing apoptosis and inflammation in vivo and in vitro[J]. Int Immunopharmacol,2015,27(1)：138-147.

[5] BAO S, ZOU Y, WANG B, et al. Ginsenoside Rg1 improves lipopolysaccharide-induced acute lung injury by inhibiting inflammatory responses and modulating infiltration of M2 macrophages[J]. Int Immunopharmacol,2015,28(1)：429-434.

[6] LI Y, WU Q, DENG Y, et al. D(-)-Salicin inhibits the LPS-induced inflammation in RAW264.7 cells and mouse models[J]. Int Immunopharmacol,2015,26(2)：286-294.

[7] 王玲,刘辉国.金雀异黄素对肺泡Ⅱ型上皮细胞发生上皮-间质转化的影响[J].中国中医药信息杂志,2016,23(10)：63-66.

[8] 金永生,刘超美.金雀异黄素的药理作用[J].国外医药：植物药分册, 2002,17(5)：190-193.

[9] 马莹莹,张育,许金鑫,等.金雀异黄素对CIA大鼠促炎和抗炎因子分泌的影响[J].实用药物与临床,2014,17(10)：1247-1251.

[10] 冯赞杰,卢志顺,刘洋,等.金雀异黄素抑制人血管平滑肌细胞中核因子κB的激活[J].中国动脉硬化杂志,2009,17(5)：363-366.

（修回日期：2016-05-18；编辑：华强）

Effects of Genistein on Inflammation and Apoptosis of Human Alveolar Epithelial Cell A549 Induced by Lipopolysaccharide

WANG Ling1, LIU Hui-guo2
(1. The Hospital of Wuhan University, Wuhan 430071, China; 2. Tongji Hospital Affiliated to Tongji Medical College of HUST, Wuhan 430030, China)

ObjectiveTo investigate the effects of Genistein (GEN) acting on human lung adenocarcinoma A549 cells induced by LPS; To discuss its action of mechanism for improving injuries of lung.MethodsThe activity of cell treated with different concentrations of Genistein was detected by CCK-8 method and / or LPS intervention for 12 h. The expressions of inflammatory cytokines IL-1β, IL-6, and TNF-α induced by LPS were detected by RT-PCR. TUNEL was used to detect apoptosis, and Western blot was used to detect the changes of signal pathway.ResultsGEN (1, 5, 10 μmol/L) alone had no effects on cell activity; LPS (1 μg/mL) reduced cell viability significantly, while co-treated the A549 cells with GEN and LPS could reverse this condition in a concentration-dependent manner; RT-PCR results showed that LPS could significantly increase the level of gene expression of inflammatory factors, while GEN could inhibited this phenomenon in both concentration-and time-dependent manner; the results of TUNEL staining showed that GEN (10 μmol/L) combined with LPS for 12 h could significantly decrease the apoptosis rate; the results of Western blot showed that GEN possibly inhibited the inflammation and apoptosis through inhibiting the phosphorylation of IκBα, p65 signaling pathways.ConclusionGEN has anti-inflammation and anti-apoptosis effects on A549 cells induced by LPS, so as to play a protective rate.

Genistein; acute lung injury; A549; inflammation; apoptosis

10.3969/j.issn.1005-5304.2017.03.014

R285.5

A

1005-5304(2017)03-0057-04

2016-04-21）