阿胶三宝膏的质量标准提高研究Δ

焦 阳，汪 冰，林永强，徐丽华（山东省食品药品检验研究院，济南 250101）

阿胶三宝膏的质量标准提高研究Δ

焦 阳＊，汪 冰，林永强，徐丽华（山东省食品药品检验研究院，济南 250101）

目的：提高阿胶三宝膏的质量标准。方法：采用超高效液相色谱-质谱联用法（UPLC-MS）鉴别制剂中的阿胶：色谱柱为Acquity UPLC BEH-C18，流动相为乙腈-0.1%甲酸溶液（梯度洗脱），流速为0.3 mL/min，进样量为5µL，离子源为电喷雾离子源，毛细管电压为3.5 kV，毛细管出口电压为120 V，锥孔电压为50 V，脱溶剂温度为400℃，干燥气流速为10 L/min，雾化器压为40 psi，碰撞能量为10～45 V，扫描范围m/z 200～1 500，检测方式为正离子模式（ESI+），多反应监测（MRM）；采用高效液相色谱法测定制剂中4种水解氨基酸的含量：色谱柱为Agela Venusil XBP-C18，流动相A为乙腈-0.1 mol/L乙酸钠溶液（36%乙酸调pH至6.5）（7∶93，V/V），流动相B为80%乙腈溶液（梯度洗脱），流速为1.0 mL/min，检测波长为254 nm，柱温为43℃。结果：阿胶的UPLC-MS图峰形清晰，专属性强，阴性无干扰。L-羟脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、L-脯氨酸检测进样量线性范围分别为0.081 9～0.655 2 μg（r＝0.999 9）、0.186 2～1.489 6 μg（r＝0.999 8）、0.070 3～0.562 0 μg（r＝0.999 9）、0.124 2～0.993 6 μg（r＝0.999 9）；精密度、稳定性、重复性试验的RSD＜2.0%；加样回收率分别为99.85%～103.69%（RSD＝1.35%，n＝6）、99.91%～103.93%（RSD＝1.46%，n＝6）、96.86%～101.27%（RSD＝1.69%，n＝6）、97.44%～101.45%（RSD＝1.54%，n＝6）。结论：提高的标准能更加有效地控制阿胶三宝膏的质量。

阿胶三宝膏由阿胶、大枣和黄芪3味中药组合而成，具有补气血、健脾胃之功效，常用于气血两亏、脾胃虚弱所致的心悸、气短、崩漏、浮肿、食少等症的治疗[1]。其最早载于《卫生部药品标准·中药成方制剂（第二册）》[2]，但仅收载了性状和常规检查项。现行标准为2015年版《中国药典》（一部），增加了采用高效液相色谱法（HPLC）测定黄芪甲苷含量和总氮量项目。本试验对现行标准进行完善，增加了制剂中君药阿胶的特征鉴别[3]，并将原标准中总氮量的测定修订为阿胶中4种水解氨基酸的HPLC定量测定[4]。

1 材料

1.1 仪器

Quattro Premier XE型超高效液相色谱-质谱联用（UPLC-MS）仪、LC-20A型HPLC仪（包括LC-20AT四元泵、SPD-20A紫外可见光检测器、DGU-20A5自动脱气装置、SIL-20AC自动进样器、CTO-20AC柱温箱）均购自美国Waters公司；CP225D型电子分析天平（德国Sartorius公司）；KQ5200DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司，功率：500 W，频率：40 kHz）。

1.2 药品与试剂

阿胶三宝膏（山东东阿阿胶股份有限公司，批号：120701、1211001、1301001，规格：250 g/瓶）；L-羟脯氨酸对照品（批号：111578-200201，纯度：100%）、甘氨酸对照品（批号：140689-201103，纯度：99.9%）、丙氨酸对照品（批号：140680-201303，纯度：99.9%）、L-脯氨酸对照品（批号：140677-201206，纯度：100%）、阿胶对照药材（批号：121274-201202）均购于中国食品药品检定研究院；胰蛋白酶（美国Promega公司，批号：ADV5280000 01120296）；乙腈、甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为纯化水。

2 方法与结果

2.1 阿胶的鉴别

2.1.1 试验条件 （1）色谱条件。色谱柱：Acquity UPLC BEH-C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流动相：乙腈（A）-0.1%甲酸溶液（B），梯度洗脱（0～25 min，5%→20%A；25～40 min，20%→50%A）；流速：0.3 mL/min；进样量：5µL。（2）质谱条件。离子源：电喷雾离子源；毛细管电压：3.5 kV；毛细管出口电压：120 V；锥孔电压：50 V；脱溶剂温度：400℃；干燥气流速：10 L/min；雾化器压：40 psi；碰撞能量：10～45 V；扫描范围：m/z 200～1 500；检测方式：正离子模式（ESI+），多反应监测（MRM）。

2.1.2 对照药材溶液的制备 取阿胶对照药材0.1 g，加1%碳酸氢铵溶液50 mL，超声处理30 min，微孔滤膜滤过，取续滤液100µL，置于微量进样瓶中，加胰蛋白酶溶液（胰蛋白酶100µg溶于1%碳酸氢铵溶液100µL中，下同）10µL，摇匀，37℃恒温酶解12 h，即得。

2.1.3 供试品溶液的制备 取样品1.0 g，加1%碳酸氢铵溶液50 mL，超声处理30 min，微孔滤膜滤过，取续滤液100µL，置于微量进样瓶中，加胰蛋白酶溶液10µL，摇匀，37℃恒温酶解12 h，即得。

2.1.4 阴性对照溶液的制备 按阿胶三宝膏处方和制备工艺制备缺阿胶的阴性样品，并按“2.1.3”项下方法制成阴性对照溶液。

2.1.5 专属性试验 取“2.1.2”“2.1.3”“2.1.4”项下对照药材溶液、供试品溶液、阴性对照溶液各适量，按“2.1.1”项下试验条件进样测定，记录色谱，详见图1。结果表明，阴性对照在相应位置未见干扰峰，方法专属性良好。

图1 对照药材、供试品、阴性对照的超高效液相色谱-质谱图Fig 1 UPLC-MS chromatograms of reference medicinal herbs，test samples and negative control

2.1.6 精密度试验 取“2.1.2”项下对照药材溶液适量，按“2.1.1”项下试验条件连续进样测定6次，记录峰面积。结果，m/z 539.8→612.4提取离子流峰与m/z 539.8→923.8提取离子流峰峰面积的RSD分别为4.32%、4.18%，表明仪器精密度良好。

2.1.7 样品鉴别 取3批样品各适量，分别按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1.1”项下试验条件进样测定，鉴别其成分，详见图2。结果，3批样品的UPLCMS出峰时间一致。

2.2 4种水解氨基酸的含量测定

2.2.1 色谱条件 色谱柱：Agela Venusil XBP-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相A：乙腈-0.1 mol/L乙酸钠溶液（36%乙酸调pH至6.5）（7∶93，V/V），流动相B：80%乙腈溶液，梯度洗脱（0～20 min，100%→93%A；20～23.9 min，93%→88%A；23.9～24 min，88%→85%A； 24～39 min，85%→66%A；39～40 min，66%→0A）；流速：1.0 mL/min；检测波长：254 nm；柱温：43℃。

图2 样品的超高效液相色谱-质谱图Fig 2 UPLC-MS chromatograms of samples

2.2.2 混合对照品溶液的制备 取待测水解氨基酸对照品适量，加0.1 mol/L盐酸溶液制成L-羟脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、L-脯氨酸质量浓度分别为0.081 9、0.186 2、0.070 3、0.124 2 mg/mL的混合对照品溶液。

2.2.3 供试品溶液的制备 取样品约2.5 g，精密称定，加0.1 mol/L盐酸溶液20 mL，超声处理30 min，放冷，加0.1 mol/L盐酸溶液定容至25 mL，摇匀。精密量取上述溶液2 mL，置于10 mL安瓿中，加2 mL盐酸，熔封，置于150℃恒温箱中1 h，放冷，移至蒸发皿中，用水10 mL分次洗涤，洗液并入蒸发皿中，蒸干，残渣加0.1 mol/L盐酸溶液溶解并定容至25 mL，摇匀，滤过，即得。

2.2.4 混合对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液的衍生化溶液的制备 分别精密量取“2.2.2”“2.2.3”“2.1.4”项下混合对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液各5 mL，加1 mol/L异硫氰酸苯酯（PITC）乙腈溶液2.5 mL，然后再加1 mol/L三乙胺乙腈溶液2.5 mL，摇匀，室温放置1 h，加50%乙腈定容至25 mL，摇匀。量取上述溶液10 mL，置于分液漏斗中，加正己烷10 mL，振摇后静置分层，取下层溶液，滤过，即得。

2.2.5 专属性试验 取“2.2.4”项下混合对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液的衍生化溶液各适量，按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱，详见图3。结果表明，阴性对照在相应位置未见干扰峰，方法专属性良好。

图3 高效液相色谱图Fig 3 HPLC chromatograms

2.2.6 线性关系考察 取待测水解氨基酸对照品适量，加0.1 mol/L盐酸溶液制成L-羟脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸和L-脯氨酸质量浓度分别为0.081 9、0.186 2、0.070 3、0.124 2 mg/mL的混合对照品溶液。分别精密量取上述混合对照品溶液1、2、4、6、8 μL，按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以待测水解氨基酸进样量（x，μg）为横坐标、峰面积（y）为纵坐标进行线性回归，得L-羟脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸和L-脯氨酸回归方程，分别为y＝1 356 820.6x—254.3（r＝0.999 9）、y＝2 065 568.1x—7 326.1（r＝0.999 8）、y＝1 675 750.1x—1 011.6（r＝0.999 9）、y＝1 561 586.887 8x+65.615 9（r＝0.999 9）。结果表明，L-羟脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸和L-脯氨酸检测进样量线性范围分别为0.081 9～0.655 2、0.186 2～1.489 6、0.070 3～0.562 0、0.124 2～0.993 6 μg。

2.2.7 精密度试验 取“2.2.4”项下混合对照品溶液的衍生化溶液适量，按“2.2.1”项下色谱条件连续进样测定6次，记录峰面积。结果，L-羟脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸和L-脯氨酸峰面积的RSD分别为0.35%、0.38%、0.37%和0.52%（n＝6），表明仪器精密度良好。

2.2.8 稳定性试验 取“2.2.4”项下供试品溶液（批号：1301001）的衍生化溶液适量，分别于室温下放置0、5、10、15、20、25 h时按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果，L-羟脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸和L-脯氨酸峰面积的RSD分别为1.27%、1.25%、1.48%和1.18%（n＝6），表明供试品溶液在室温放置25 h内基本稳定。

2.2.9 重复性试验 精密称取同一批样品（批号：1301001）适量，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.2.4”项下方法制备供试品溶液的衍生化溶液，共6份，再按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，计算含量。结果，L-羟脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸和L-脯氨酸平均含量分别为 8.33、16.37、6.96、13.89 mg/g，RSD分别为1.61%、1.94%、1.19%、1.69%（n＝6），表明本方法重复性良好。

2.2.10 加样回收率试验 取已知含量样品（批号：1301001）适量，共6份，分别加入一定质量的待测水解氨基酸对照品，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，另按“2.2.4”项下方法制备供试品溶液的衍生化溶液，再按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算加样回收率，结果见表1。

表1 加样回收率试验结果（n＝6）Tab 1 Results of recovery tests（n＝6）

2.2.11 样品含量测定 取3批样品各适量，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，另按“2.2.4”项下方法制备供试品溶液的衍生化溶液，再按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算样品含量，结果见表2。结合阿胶三宝膏中阿胶的处方量和制成总量计算4种水解氨基酸的理论含量分别为7.2、16.2、6.3和9.0 mg/g。考虑水分、制剂工艺等影响因素，并结合实际测定结果，暂定限度为每1 g含阿胶以L-羟脯氨酸计，不得少于6.1 mg；以甘氨酸计，不得少于13.8 mg；以丙氨酸计，不得少于5.4 mg；以L-脯氨酸计，不得少于7.7 mg。

3 讨论

阿胶是马科动物驴Equus asinus L.的干燥皮或鲜皮经煎煮、浓缩制成的固体胶，是我国的传统中药，具有滋阴补血、润燥、止血之效。处方中含有阿胶的中药制剂品种繁多，但由于现行方法对制剂中阿胶的质量控制缺乏针对性，专属性较差。不法厂家用其他劣质皮类替代驴皮熬制阿胶的违法行为时有发生，导致此类制剂质量良莠不齐，药效无法得到保障。

表2 样品含量测定结果（n＝3）Tab 2 Results of contents determination of samples（n＝3）

本试验采用UPLC-MS法，建立了阿胶特征肽的专属性鉴别，结果表明，本鉴别方法高效、快速、专属性强，耐用性强，可有效地对阿胶三宝膏中的阿胶进行鉴别。

本试验参照2015年版《中国药典》（一部）阿胶项下含量测定的方法，建立了阿胶三宝膏中阿胶4种水解氨基酸的HPLC含量测定项。由于制剂处方中还含有大枣和黄芪，水溶性杂质较多，因此笔者根据制剂的实际情况优化液相条件，延长洗脱时间，以获得更好的分离度。按优化后的色谱方法进行试验，所得数据线性关系、精密度、重复性和回收率均良好。

综上所述，提高的标准能更加有效地控制阿胶三宝膏的质量。

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S].2015年版.北京：中国医药科技出版社，2015：1010.

[2] 国家药典委员会.卫生部药品标准：中药成方制剂：第二册[S].WS3-B-0297-90.

[3] 程显隆.胶类药材质量控制关键技术研究[D].北京：北京中医药大学，2014.

[4] 陈再洁，殷金龙，李坤，等.柱前衍生RP-HPLC法测定人参中17种氨基酸的含量[J].中国药房，2012，23（35）：3334-3337.

Study on the Improvement of Quality Standard for Ejiao Sanbao Cream

JIAO Yang，WANG Bing，LIN Yongqiang，XU Lihua（Shandong Institute for Food and Drug Control，Jinan 250101，China）

OBJECTIVE：To improve the quality standard of Ejiao sanbao cream.METHODS：UPLC-MS was adopted to identify the donkey-hide glue in the preparation，the chromatographic conditions：column was Acquity UPLC BEH-C18with mobile phase of acetonitrile-0.1%formic acid（gradient elution），volumetric flow rate was 0.3 mL/min，injection volume was 5 μL，ion source is electrospray ionization source，capillary voltage was 3.5 kV，capillary outlet voltage was 120 V，cone voltage was 50 V，desolvation temperature was 400℃，drying gas flow was 10 L/min，nebulizer pressure was 40 psi，collision energy was 10-45 V，scan range was m/z 200-1 500；detection mode was positive ion mode（ESI+），multiple reaction monitoring.HPLC was used to determine the contents of 4 hydrohyzing amino acid：column was Agela Venusil XBP-C18with mobile phase A of acetonitrile-0.1 mol/ L sodium acetate solution（36%acetic acid adjusted to pH 6.5）（7∶93，V/V）and B of 80%acetonitrile solution（gradient elution）at a flow rate of 1.0 mL/min，the detection wavelength was 254 nm，and column temperature was 43℃.RESULTS：The UPLC-MS peak of Equus asinus was clear and specific，without negative interference.The linear range was 0.081 9-0.655 2 μg for L-hydroxyproline（r＝0.999 9），0.186 2-1.489 6 μg for glycine（r＝0.999 8），0.070 3-0.562 0 μg for alanine（r＝0.999 9）and 0.124 2-0.993 6 μg for L-proline（r＝0.999 9）；RSDs of precision，stability and reproducibility tests were lower than 2.0%；recoveries were 99.85%-103.69%（RSD＝1.35%，n＝6），99.91%-103.93%（RSD＝1.46%，n＝6），96.86%-101.27%（RSD＝1.69%，n＝6）and 97.44%-101.45%（RSD＝1.54%，n＝6），respectively.CONCLUSIONS：The improved standard can more effectively control the quality of Ejiao sanbao cream.

Ejiao sanbao cream；Quality standard；UPLC-MS；HPLC

R927.2

A

1001-0408（2017）03-0376-05

2016-02-09

2016-04-25）

（编辑：张 静）

国家科技重大专项课题（No.2014ZX09304307-002-002）；山东省自然科学基金资助项目（No.ZR2013HM074）

＊药师。研究方向：药物分析。电话：0531-81216522。E-mail：jiaoyang579@hotmail.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.03.25

关键词阿胶三宝膏；质量标准；超高效液相色谱-质谱联用法；高效液相色谱法