水稻细胞质雄性不育恢复基因Rf6功能标记开发及微核心种质中Rf6基因的筛选

徐 雪，王 英，邹礼平，魏 朗，彭 方，黄文超，段俊枝，姚国新,*

(1.湖北工程学院 生命科学技术学院，湖北 孝感 432000； 2.湖北神农架林区农林局，湖北 神农架林区 442499；3.杂交水稻国家重点实验室/武汉大学 生命科学学院，湖北 武汉 430072； 4.河南省农业科学院 农业经济与信息研究所，河南 郑州 450002)

水稻细胞质雄性不育恢复基因Rf6功能标记开发及微核心种质中Rf6基因的筛选

徐 雪1，王 英2，邹礼平1，魏 朗1，彭 方1，黄文超3，段俊枝4，姚国新1,3*

(1.湖北工程学院 生命科学技术学院，湖北 孝感 432000； 2.湖北神农架林区农林局，湖北 神农架林区 442499；3.杂交水稻国家重点实验室/武汉大学 生命科学学院，湖北 武汉 430072； 4.河南省农业科学院 农业经济与信息研究所，河南 郑州 450002)

核恢复基因Rf6是红莲型杂交水稻特有的新恢复基因，为了寻找更多具有Rf6恢复基因的种质，以扩展红莲型杂交水稻的恢复系来源，组配更多优良杂交品系，利用Rf6及其等位基因的序列差异，开发Rf6基因的功能标记，并利用该标记对中国水稻微核心种质进行PCR扩增，筛选具有Rf6恢复基因的种质。结果表明，在324 bp插入片段(Rf6较其等位基因插入324 bp)两侧设计引物(正向引物：5′-ATGACAAGAGGACCAGCGATGCAATGG-3′,反向引物：5′-ATTCTTGCAGAGATAGACCATGAGCGTG-3′)，利用该引物可扩增出条带清晰且无杂带的差异片段，可用于Rf6基因的鉴定。利用该标记在197份中国水稻微核心种质中筛选出22份具有Rf6恢复基因的种质，可为拓宽红莲型杂交水稻的恢复系来源提供材料。

红莲型水稻； 恢复基因Rf6； 微核心种质

细胞质雄性不育(cytoplasmic male sterility，CMS)是植物界一种普遍现象，是指植物不能产生花粉或产生的花粉无活力, 导致雄蕊不能正常授粉而雌蕊功能正常的一种母性遗传现象。核恢复基因(restorer of fertility，Rf)是能够恢复CMS花粉育性的基因，利用CMS/Rf系统可大量生产杂交种。目前，水稻CMS主要有3种类型：野败型(WA)、红莲型(HL)和包台型(BT)。研究表明，orf79和orfH79分别是WA和HL型CMS的不育基因[1]，Rf1恢复BT型CMS的育性[2]，Rf3和Rf4恢复WA型CMS的育性[3-4]，Rf5和Rf6恢复HL型CMS的育性[5-6]。Rf1和Rf5是等位基因，Rf6是新发现的HL型CMS的特有恢复基因，对其他类型CMS不具有恢复功能。恢复基因的来源直接限制HL型杂交水稻的组配，对杂种优势的利用起着决定性的作用。目前，Rf6基因已经被定位克隆，与其等位基因rf6相比，Rf6基因存在3个重复插入序列，比rf6基因长324 bp，rf6由于缺失插入序列而失去育性恢复功能[7]。传统寻找恢复系的方法是与不育系进行杂交，考察下一代F1的花粉育性，能够恢复花粉育性的材料可作为恢复系利用，这种方法比较盲目，缺乏针对性，而且耗时长。开发恢复系恢复基因功能分子标记，筛选具有恢复基因的材料，进行组合配制，可减少工作量，节省时间。目前，尚未见Rf6基因功能标记开发的报道，本研究在Rf6基因插入的324 bp序列两侧设计基因内功能分子标记，对中国栽培水稻微核心种质进行筛选，以期从中获得含有Rf6恢复基因的种质，用于HL型杂交水稻恢复系选育。

1 材料和方法

1.1 试验材料

197份中国栽培稻微核心种质由中国农业大学李自超教授实验室提供，9311(阳性对照)、日本晴(Nip，阴性对照)、粤太A(YTA)、粤太(YTB)和宁粳3号(NJ3)等材料由杂交水稻国家重点实验室种植保存。2016年5月，所有材料种植于湖北孝感，常规方法种植管理。

1.2 引物设计

Rf6及其等位基因序列由NCBI网站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)下载，采用Primer Premier 5和Gene Runner设计功能标记引物YRf6。

1.3 DNA提取、RCR扩增及电泳

取3叶期幼苗叶片，采用CTAB法提取各材料DNA，稀释至20 ng/μL，于-20 ℃保存备用。PCR反应体系为10 μL，包含Taq酶0.10 μL(2.5 U/μL)、引物1.5 μL(10 mmol/L)、dNTP 0.1 μL(10 mmol/L)、DNA 1 μL(20 ng/μL)、10×buffer 1.0 μL、灭菌蒸馏水 6.3 μL。扩增程序为95 ℃预变性5 min；95 ℃ 30 s、55 ℃ 40 s、72 ℃ 50 s，共35个循环。采用2%的琼脂糖凝胶电泳30 min，EB染色后，采用Gellogic 200成像系统读带分析。

2 结果与分析

2.1Rf6基因功能标记的设计与扩增效果

与没有育性恢复功能的rf6基因相比，有育性恢复功能的Rf6基因存在324 bp的插入序列[7]。因此，将YRf6引物(表1)设计在324 bp插入位点前后，用该标记可扩增出763/439 bp的片段。为了鉴定该标记的扩增效果，用该标记对9311、YTA、YTB、Nip和NJ3的DNA进行扩增，扩增结果如图1所示，条带清晰且无杂带，可用于Rf6基因的鉴定。

表1 YRf6标记的序列及扩增长度

2.2 中国栽培水稻微核心种质中Rf6基因的筛选

对197份中国栽培稻微核心种质进行DNA提取，然后利用设计的YRf6标记进行PCR扩增，部分扩增电泳结果见图2。扩增结果清晰，区分效果良好。所有扩增结果整理汇总于表2中，共筛选到含Rf6恢复基因的材料22份，占微核心种质材料的11.2%，其中四川(5份)、云南(4份)和福建(3份)省是分布较多的省份，在东北和西北地区的水稻微核心种质中没有检测到Rf6基因。

图1 YRf6功能标记的扩增效果

图2 部分微核心种质中Rf6恢复基因的扩增电泳结果(编号材料名称与表2对应)

编号名称来源有无Rf6编号名称来源有无Rf6编号名称来源有无Rf6编号名称来源有无Rf619311江苏+51麻谷子陕西-103秋前白安徽-162墨米广西-2NIP(日本晴)日本-52白毛稻黑龙江-104肥东塘稻安徽-163粳87-304湖南-3葡萄黄天津-53黄丝桂占广东-105台山糯江西-164湘晚籼3号湖南-4六十早安徽-54丹东陆稻辽宁-106矮禾迟江西-165镇籼232江苏+5清可云南-55闷加丁2海南-108陆财号福建+166早籼240安徽-6老造谷云南-56齐眉广东-110饿死牛广东-167郑稻5号河南-7麻谷糯贵州-57叶里藏花河北-111白壳花螺广东-168万利籼湖南-8滇瑞409B云南-58金优1号福建-112赤壳糯广东-169矮仔占广西-9饭毫皮云南-59齐头白谷云南-115霸王鞭1湖北-170盐水赤福建+10包二幅海南-60紫糯云南-116须谷糯湖南-171西什15广东-1188B江苏-61泸科3号四川+117红旗5号湖南-172红粳旱谷广西-12四倍体朝6北京-62辽粳287辽宁-118细白粘四川-173拉木加云南-13香谷云南-63湘早籼7号湖南-119南天纲酒四川-17480B湖南-14旱麻稻河南-64齐头谷云南-120中农4号四川-175古154湖南-15三粒寸广东-65台东陆稻台湾-121三颗寸四川+176圭630湖南-16南京11号江苏-66鱼眼糯云南-122本邦谷云南-177IR661-1湖南-17一支香福建-67红米三担江西-125毫莱云南+178培C122湖南-18鼠牙占广东-68湖恢628湖南-126金枝糯云南-179粳7623上海-19矮密江西-69丝苗广东-127鸡血糯云南-180宁恢21江苏-20洞庭晚籼湖北-69宣恩长坛湖北-128乌咀红谷云南-18176-1辽宁-21公居73云南-70魔王谷内云南-129背子糯云南-182特青选恢湖南-22毫虑光粘贵州-71三七十云南-130泽谷贵州-183JWR221江苏-23金溪白江西-72老红稻陕西-131香糯贵州-184横县良春广西-24台中籼选2台湾-73小红谷云南-132马尾粘贵州+185山酒谷四川-25有芒早粳上海-74寸三粒江苏-134阳壳糯贵州-186冷水糯云南+26台中在来1台湾-76广陆矮4号广东+136加巴拉西藏-187毫香云南+27丹东陆稻辽宁-77湘晚籼1号湖南-137包选21号广东-188金南特B湖南-28当育5号安徽-78五子堆云南-138文香糯云南+189竹珍B湖南-29高阳淀稻河北-79闽北晚籼福建-139毫补卡云南-190朝阳一号B湖南+30毫荒腊云南-80闷加高1海南-140大弯糯云南-191L301B湖南-31隆化毛葫河北-81桂朝2号广东-141毫巴永1云南-192安农晚粳B湖南-32秕五升云南-82南特号江西-142冷水谷2云南-193金南特43B湖南+33矮沱谷151四川-83柳叶粘湖北+143黄皮糯云南-194早熟农虎6湖南-34成农水晶四川-84京虎B安徽-144半节芒云南-195青四矮16B广东-35白壳旱禾湖南-85黑督4广东-145八百粒云南-196珍汕97B江西-36油粘贵州-86湘恢91269湖南-147飞蛾糯2贵州-197献改B江西-37金包银福建-87二钢矮广东-148紫芒飞蛾贵州-198江农早1号江西-38毫马克(K)云南-88三百粒江西-149洞庭晚籼湖北-199黎明B辽宁-39台中65号台湾-89红壳折糯贵州-150柳沙1号广西-200包协-7B湖南-40小白米贵州-90香稻河南-151桂花黄江苏-201G珍汕97B四川+41紫米云南-91红谷四川-152苏粳2号江苏-204中楼一号山西-42七月籼广西-92南雄早油广东-153成都矮3号四川-205兴国吉林-43矮麻抗四川-93梅花糯四川+154立新粳四川-206雷火占安徽+44红矮糯广西-94水原300粒河北-155黑粳2号黑龙江-207麻麻谷四川+45木瓜糯湖南-95寸谷糯贵州-156广陆矮15-1广西-210卫国辽宁-46解放籼江西-96木樨球上海-157红晚1号福建+211百歌稻江苏-47包协123B湖南-97铁秆乌浙江-158湘矮早10湖南-213乌壳占福建-48光壳香糯广西-98秀水115浙江-159扬稻2号江苏-214南高谷云南-49郴晚3号湖南-99二九南1号浙江+160晋稻1号山西+215细麻线云南-50贯推白禾1贵州-1100矮脚南特广东+161早熟香黑广西-

注：+表示能检测出Rf6基因，-表示未检测出Rf6基因。

3 结论与讨论

3.1 拓宽Rf6恢复基因资源，加速HL型杂交水稻发展

Rf6恢复基因携带材料占微核心种质的11.2%，种质资源较少，若采用杂交方法筛选效率很低，工作量大，采用分子功能标记筛选，效率很高。HL型核质互作不育系的强恢复系具备2对恢复基因Rf5和Rf6，可抵抗高温等逆境[8]，更加稳产。其中，Rf5恢复基因的资源丰富，制约强恢复系选育的一个重要原因可能是Rf6恢复基因资源较少。目前,已经选育出一系列高产、优质HL型杂交水稻品种，在生产上其推广面积累计超过600万hm2[8]，但其恢复系基本局限于9311及其改良品系，来源狭窄。筛选的22份含有Rf6基因的种质资源会拓宽HL型杂交水稻恢复系的选育来源。

3.2 充分挖掘微核心种质蕴藏的基因资源，促进水稻优异基因聚合育种

我国是水稻重要的起源地之一，在南方许多省份都蕴含着丰富的遗传育种资源。我国保存的水稻种质已经超过7万份，最少的样本保存最大的基因资源是构建微核心种质库的目的，同时利用微核心种质寻找优异基因也是重要目标。针对微核心种质的基因资源筛选方面已有不少报道，在抗病、抗旱、耐冷等方面获得了非常好的进展[9-12]。在育性恢复基因、广亲和基因等方面的资源筛选是进一步挖掘微核心种质基因库优异基因的重要内容，更多优异基因和优异种质是培育高产、优质、抗病和广适水稻新品种的基础。

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[2] Komori T,Ohta S,Murai N,etal.Map-based cloning of a fertility restorer gene，Rf-1，in rice(OryzasativaL.)[J].The Plant Journal，2004，37(3):315-325.

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Functional Markers Development of Restore GeneRf6 in Rice and Screening ofRf6 in Micro-core Collections

XU Xue1,WANG Ying2,ZOU Liping1,WEI Lang1,PENG Fang1,HUANG Wenchao3,DUAN Junzhi4，YAO Guoxin1,3*

(1.School of Life and Science Technology,Hubei Engineering University,Xiaogan 432000,China; 2.Agricultural and Forestry Bureau of Shengnongjia Forest Region,Shengnongjia Forest Region 442499,China； 3.College of Life Sciences,Wuhan University/State Key Laboratory of Hybrid Rice,Wuhan 430072,China; 4.Institute of Agricultural Economy and Information,Henan Academy of Agricultural Sciences,Zhengzhou 450002,China)

Rf6 is a new rice restoring gene of HL type,in order to select more restoring lines withRf6 for increasing restoring lines to hybrid more combinations,the functional marker ofRf6 was developed according to the difference of sequence ofRf6 and its allele,and this marker was used to screen lines withRf6 among Chinese rice micro-core collections.The results indicated that the marker designed in both sides of the inserted 324 bp fragment(there was a 324 bp inserting fragment betweenRf6 and its allele)could generate clear andnon-background production,and this marker(forward sequence 5′-ATGACAAGAGGACCAGCGATGCAATGG-3′, reverse sequence 5′-ATTCTTGCAGAGATAGACCATGAGCGTG-3′)could identifyRf6 germplasm. Twenty-two lines includingRf6 restoring gene were selected in 197 Chinese rice micro-core collections using the above marker,and these materials would broaden restoring lines of HL hybrid rice.

HL type rice; restoring geneRf6; micro-core collections

2016-11-04

杂交水稻国家重点实验室(武汉大学)开放课题基金项目；湖北省自然科学基金项目(2016CFB510)

徐 雪(1992-)，女，湖北襄阳人，在读硕士研究生，研究方向：作物遗传育种。

*通讯作者：姚国新(1977-)，男，湖北当阳人，副教授，博士，主要从事水稻杂种优势研究。E-mail:guoxiny2004@hbeu.edu.cn

S435.72

A

1004-3268(2017)02-0012-04