MALAT1在结直肠癌组织细胞中的表达及对化疗敏感性的影响

汪栋++++++金岚++++++王今++++++白志刚++++++王婷婷++++++赵晓牧++++++吴国聪++++++杨盈赤

[摘要] 目的 探讨MALAT1在结直肠癌组织细胞中的表达及对化疗敏感性的影响，并对其机制进行初步研究。 方法 收集首都医科大学附属北京友谊医院普外科2015年6～12月手术切除结直肠癌组织33例及相应癌旁正常组织33例，采用RT-PCR方法检测MALAT1的表达水平；采用慢病毒敲减MALAT1后，检测MALAT1在结直肠癌细胞sw620及sw480中的表达水平；MTS方法检测MALAT1在结直肠癌增殖及化疗疗效中的作用，Western blot检测相关通路蛋白表达变化。 结果 结直肠癌组织中MALAT1的表达水平较癌旁正常组织显著增高（t = 4.138，P = 0.009），慢病毒si-MALAT1显著敲减MALAT1的表达水平。MALAT1敲减后，sw620及sw480细胞的增殖均减低（t = 2.957，P = 0.009；t = 1.936，P = 0.017），且对氟尿嘧啶、奥沙利铂的敏感性增加。下调MALAT1后，PI3K及p-AKT的水平下调，而总AKT水平无明显变化。 结论 MALAT1在结直肠癌增殖及耐药过程中发挥重要作用，其可能成为结直肠癌潜在的治疗靶点。

[关键词] 结直肠癌；MALAT1；化疗；耐药

[中图分类号] R735.35 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2016）11（b）-0012-05

[Abstract] Objective To explore the expression of MALAT1 in colorectal cancer tissue cells and its influence for the chemotherapy sensitivity， in order to preliminary study the mechanism. Methods Thirty-three cases with colorectal cancer tissue and 33 cases with normal tissue adjacent to carcinoma in Department of General Surgery， Beijing Friendship Hospital， Capital Medical University from June to December 2015 were collected and performed RT-PCR method to detect the levels of MALAT1. After introducing the lentivirus to knock down MALAT1， the expression levels of MALAT1 in sw620 and sw480 of colorectal carcinoma cells were detected. MTS method was used to detect the effectiveness of proliferation and chemotherapy resistance in colorectal cancer. Western blot detection was adopted to detect the protein expression changes of related pathways. Results The expression levels of MALAT1 in colorectal cancer tissue were significantly higher than the normal tissue adjacent to carcinoma （t = 4.138， P = 0.009）， si-MALAT1 knocked down the expression level of MALAT1 obviously. After knockdown of MALAT1， the proliferation of sw480 and sw620 cell was slowed down （t = 2.957， P = 0.009； t = 1.936， P = 0.017）， and they were more sensitive for 5-FU and Oxaliplatin. After decreasing the level of MALAT1， the levels of P13K and p-AKT were decreased， while the level of AKT had no significant difference. Conclusion MALAT1 plays an important role in proliferation and chemotherapy resistance of colorectal cancer， which may be a potential therapeutic target for the treatment of colorectal cancer.

[Key words] Colorectal cancer； MALAT1； Chemotherapy； Drug resistance

长链非编码RNA（lncRNA）是一种长度大于200个核苷酸的RNA分子，由于缺乏开放阅读框，lncRNA并不编码蛋白质，而是以RNA的形式在表观遗传学、转录水平和转录后3个层面调控基因表達[1-2]，从而在肿瘤的发生发展及转移等多个过程中发挥重要作用[3-5]。肺腺癌相关转录因子1（metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1，MALAT1）是最早发现的长链非编码RNA之一，最初发现于人类非小细胞肺癌[6]，在肺癌、膀胱癌、肝癌等多种恶性肿瘤中均呈现异常表达的状态，可以影响肿瘤的发生、侵袭和迁移[7-9]，但是其与肿瘤耐药相关性研究较少，目前仅有研究证实MALAT1可以降低胰腺癌细胞的化疗敏感性。本研究拟观察MALAT1对于结直肠癌细胞增殖及化疗药物应答的影响，并对相关机制进行初步探讨。

1 材料与方法

1.1 细胞与试剂

人结直肠癌细胞株sw620、sw480，保存于首都医科大学附属北京友谊医院（以下简称“我院”）普外科实验室；干扰慢病毒siMALAT1和空载慢病毒si-CON购于上海吉玛制药技术有限公司；DMEM培养基及胎牛血清购自美国Gibco公司；RNA逆转录试剂盒购于北京天根生化科技有限公司；SYBRRGreen购于上海东洋坊生物科技有限公司；引物由上海生工生物有限公司合成；一抗及二抗均购自美国CST公司；MTS购于美国Sigma公司；氟尿嘧啶（5-Fu）：上海金穗生物科技有限公司；奥沙利铂：购于赛诺菲圣德拉堡民生制药。BCA蛋白定量试剂盒购于江苏凯基生物技术股份有限公司。组织样本来源于我院普外科2015年6～12月手术切除的结直肠癌组织33例及相应癌旁正常组织33例，患者年龄44～85岁，平均（61.4±12.6）岁，其中男18例，女15例。根据AJCC的结直肠癌分期，肿瘤浸润深度情况：T1期0例，T2期6例，T3期15例，T4期11例；淋巴结转移情况：N0患者10例，N1～N2患者23例；远处转移情况：M0患者19例，M1患者14例。全部标本均由专业病理科人员指导采集并经病理学证实。

1.2 实验方法

1.2.1 实时荧光定量PCR法检测结直肠癌组织及癌旁正常组织中MALAT1的表达 总RNA采用Trizol法进行提取，按照说明书进行逆转录。实时定量PCR反应体系如下：SYBRRGreen mix 10 μL；上游引物1 μL；下游引物1 μL；cDNA 1 μL；RNA/DNAase free water補至20 μL。反应条件：95℃热启动10 min；95℃变性10 s，60℃退火20 s，72℃延伸10 s，共40个循环。MALAT1及内参的引物序列见表1。

1.2.2 制备MALAT1敲减稳定细胞株 结直肠癌细胞sw480，sw620均感染慢病毒siMALAT1以制备MALAT1敲减稳定细胞株，分别记作sw480 si-MALAT1及sw620 si-MALAT1。感染空载慢病毒si-CON作为相应阴性对照组，分别记作sw480 si-CON以及sw620 si-CON。

1.2.3 MTS法检测结直肠癌细胞株的药物应答 sw620 si-CON、sw620 si-MALAT1细胞分别以0.25%胰酶消化，计数，以2000个/孔接种入96孔板内。待细胞贴壁后分别加入不同浓度的化疗药，设0.001、0.01、0.1、1、10、100、1000 μmol/L共7个药物浓度，每个药物浓度设3孔重复。药物处理48 h后加入MTS 20 μL/孔，4 h内在酶标仪上检测波长490 nm的OD值。寇氏改良法计算药物对细胞的IC50值，即细胞死亡50%时的药物浓度。

1.2.4 MTS法检测结直肠癌细胞株的生长曲线 sw480 si-CON、sw480 si-MALAT1以及sw620 si-CON、sw620 si-MALAT1细胞分别以0.25%胰酶消化，计数，以1000个/孔接种入96孔板内。于接种后第12、24、48、72小时在酶标仪上检测OD490值。

1.2.5 免疫印迹法检测细胞株中MALAT1下游蛋白的表达 细胞消化后，收集提取总蛋白，采用BCA法蛋白对其进行定量。以等量蛋白进行10%的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳和半干转法转膜。然后将硝酸纤维素膜用5%的脱脂牛奶封闭1 h。之后将纤维素膜与一抗杂交4℃过夜，TBST漂洗3次后与辣根过氧化酶标记的二抗室温孵育1 h后进行显色、拍照。用凝胶成像分析系统测定光密度，以GAPDH为内参进行蛋白的相对定量分析。

1.3 统计学方法

采用SPSS 11.0统计软件进行数据统计分析。计量资料以均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MALAT1在结直肠癌及癌旁正常组织中的表达

采用实时荧光定量PCR方法检测33例结直肠癌及33例癌旁正常组织标本中MALAT1的表达水平。与正常组织相比，结直肠癌组织中MALAT1的表达量显著上调，且差异有统计学意义（t = 4.138，P = 0.009）。见图1。

2.2 慢病毒颗粒的感染效率

应用慢病毒颗粒感染人结直肠癌SW620、SW480细胞，48 h后在荧光倒置显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达，以分析感染效率。结果显示，48 h后转染效率可达80%左右。见图2。

2.3 不同病毒感染结直肠癌SW620、sw480细胞后MALAT1表达水平的变化

采用实时荧光定量PCR法检测不同慢病毒感染人结直肠癌SW620、SW480细胞后MALAT1的表达变化。结果显示，SI-MALAT1病毒的感染使SW620、SW480细胞中MALAT1的表达明显下降。统计学分析显示，MALAT1干扰组与对照组的表达差异有统计学意义，即干扰后的相对表达值与未干预的值（1）比较，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表2。

2.4 不同病毒感染结直肠癌细胞sw620、sw480后细胞的增殖情况

采用MTS方法检测si-CON、si-MALAT1稳定细胞株的增殖能力有无改变。结果显示，干扰MALAT1后sw480与sw620的增殖能力均明显减弱，以72 h时细胞增殖的差异最为明显（P < 0.05）。见图3。

2.5 不同病毒感染结直肠癌细胞sw620后细胞的药物敏感性

MTS法检测5-Fu对si-CON及si-MALAT1细胞的IC50分别为（14.48±3.78）、（3.18±0.15）μmol/L（t = 1.429，P = 0.031）。奥沙利铂对si-CON及si-MALAT1细胞的IC50分别为（53.10±1.39）、（7.71±0.29）μmol/L（t = 2.356，P = 0.006）。药物的剂量存活曲线如图4所示，结果显示MALAT1干扰之后细胞对奥沙利铂及5-Fu的敏感性均提高。

2.6 Western blot检测不同病毒感染的sw620细胞株中各种下游蛋白水平

Western blot检测si-CON与siMALAT1细胞的PI3K/AKT信号通路相关蛋白的表达，结果显示PI3K及p-AKT明显下调，而总AKT水平无明显变化。见图5。

3 讨论

lncRNA是指转录本长度大于200 nt的功能性RNA分子，由于没有开放阅读框而不能编码蛋白质。尽管如此，lncRNA仍然可以通过多种方式影响蛋白表达，包括调节蛋白结合因子的活性，转录后加工生成多种RNA，诱导染色质修饰复合物的定位与结合等，从而参与肿瘤细胞的各种生物学行为，包括增殖、侵袭、迁移以及肿瘤化疗耐药等[10-11]。

MALAT1是最早发现的长链非编码RNA之一，最初发现于人类非小细胞肺癌，是一个高度保守的lncRNA，在种属间存在高度同源序列，因此推测其在肿瘤的发生发展中可能扮演重要角色[12]，有文献报道，MALAT1在肝癌、非小细胞肺癌及前列腺癌等多种肿瘤组织中表达上调，提示MALAT1可能是致癌的lncRNA[13]。本研究采用RT-PCR的方法检测11对结直肠癌组织及癌旁正常组织中MALAT1的表达，结果显示MALAT1在癌组织中明显上调（P = 0.013），这也与之前在其他肿瘤中的研究结果一致[14-16]。

为了进一步研究MALAT1在结直肠癌中的生物学功能，本研究利用慢病毒感染建立了MALAT1干擾及其空载对照的结肠癌细胞稳定株。通过RT-PCR的方法对干扰效果进行验证，干扰后sw620和sw480的MALAT1表达水平分别为相应的对照组的0.15倍和0.22倍，证明干扰效果较好。Schmidt等[7]在干扰MALAT1之后对非小细胞肺癌细胞A549的增殖情况进行检测，发现MALAT1表达下调能有效抑制A549细胞的增殖，Wang等[13]的实验同样证实MALAT1可促进胃癌细胞的增殖。本研究MALAT1敲减后两株结直肠癌细胞的增殖性明显降低。在用不同浓度的5-Fu/奥沙利铂处理细胞48 h后，MALAT1干扰的sw620细胞对化疗药物5-Fu和奥沙利铂的敏感性明显升高。

5-Fu和奥沙利铂是常用的治疗结直肠癌的化疗药物，已在临床应用多年，但是耐药一直是临床上令人棘手的问题。多项研究证实lncRNA与肿瘤耐药的发生密切相关[17-18]。例如CUDR在耐多柔比星鳞癌细胞中高表达，细胞转染CUDR后Caspase-3通路功能下调，提示CUDR可能通过调控Caspase-3通路进而调控肿瘤耐药[14]。而Yang等[15]研究者发现lncRNA HOTAIR在肝癌组织中显著上调，而干扰HOTAIR的表达水平后可显著逆转HepG2细胞对顺铂及多柔比星的耐药性。因此本研究希望能探讨MALAT1与结直肠癌化疗耐药的关系，本研究采用慢病毒敲减MALAT1在两株结直肠癌细胞中的表达水平，观察MALAT1敲减之后细胞的增殖及对于不同化疗药物敏感性的变化，结果显示MALAT1敲减后结直肠癌细胞增殖减慢且对化疗药物的敏感性增强，提示MALTA1可能为克服结直肠癌耐药的潜在靶点。

为了进一步探讨MALAT1调控结直肠癌增殖和耐药的可能机制，本研究利用Western blot分析了PI3K/AKT信号通路相关蛋白的表达水平。PI3K/AKT信号传导通路是细胞增殖的重要通路之一，在调节细胞的增殖方面起重要作用，其与药物耐药性关系的研究也越来越多，被认为是化疗耐药治疗的重要靶点[16-17]。文献报道PI3K/AKT信号传导通路在多种胃肠道恶性肿瘤中过度活化[18]。Oki等[19]报道了AKT的活化与多种化疗药物如5-Fu、顺铂等耐药相关，而Jin等[20]发现卵巢癌吉西他滨耐药细胞株中PI3K/AKT通路异常活化，而在乳腺癌细胞株MCF7中，PI3k/AKT活性的升高导致其对紫杉醇和5-Fu等耐药，而抑制该通路可以逆转MCF7的耐药性。

本研究结果显示，在结直肠癌细胞sw620中敲低MALAT1之后，PI3K及p-AKT的表达水平显著下降，而总AKT水平并未明显变化。由此提示MALAT1可能通过激活PI3K/AKT信号通路影响结直肠癌细胞的增殖和药物应答，其可能是潜在的结直肠癌治疗靶点。

目前对于MALAT1的研究主要是通过肿瘤细胞培养，但其在体内与体外的作用是否一致，还有待进一步研究。肿瘤的信号通路交错成网，因此除了PI3K/AKT信号通路，可能尚有其他信号通路参与到结直肠癌耐药的机制中，这些信号通路之间的相互作用仍需深入探讨，为更好地克服肿瘤耐药提供理论依据。

基于以上细胞学实验，MALAT1在结直肠癌中表达显著上调，在结直肠癌增殖及耐药过程中扮演重要角色，其可能通过PI3K/AKT信号通路发挥重要的生物学作用，影响结直肠癌的增殖及化疗耐药，其可能是潜在的结直肠癌治疗靶点。

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