caspase—3、HSP70表达在子痫前期发病机制中的作用

李延辉+梁媚珍+蒋洁珊

【摘要】 目的：探讨子痫前期患者胎盘组织中caspase-3、HSP70的表达情况及其作用机制。方法：选择本院住院治疗的子痫前期孕妇45例为研究组，正常孕妇45例为对照组。收集两组的胎盘组织标本，采用免疫组化法检测两组胎盘组织中caspase-3、HSP70的表达。结果：研究组胎盘组织中caspase-3蛋白和HSP70蛋白的陽性表达率分别为62.2%、55.6%，均显著高于对照组的4.4%、11.1%，差异均有统计学意义（ 字2=11.65、9.37，P<0.01）。随着研究组孕妇的病情加重，胎盘组织中caspase-3蛋白和HSP70蛋白表达均呈上升趋势，重度子痫前期孕妇胎盘组织中caspase-3蛋白和HSP70蛋白的阳性表达率均明显高于轻度子痫前期孕妇（ 字2=9.91、7.93，P<0.01）。研究组中HSP70蛋白的表达和caspase-3蛋白的表达呈负相关（r=0.582，P<0.01）。结论：caspase-3和HSP70的异常表达不仅可能参与了子痫前期形成过程，而且也在子痫前期患者病情进展过程中发挥重要作用，两者之间可能存在相互作用。

【关键词】 子痫前期； caspase-3； HSP70； 血管内皮细胞； 凋亡

【Abstract】 Objective：To investigate the expression of caspase-3 and HSP70 in the placenta of patients with preeclampsia and its mechanism.Method：45 preeclampsia pregnant women in our hospital were selected as study group and 45 normal pregnant women as control group.Placental tissue samples were collected，and the expression of caspase-3 and HSP70 in the two groups were detected by immunohistochemical method.Result：The positive expression rates of caspase-3 protein and HSP70 protein in placenta tissue of the study group were 62.2% and 55.6%，respectively，which were significantly higher than 4.4%，11.1% of the control group，the differences were statistically significant（ 字2=11.65，9.37，P<0.01）.The expression of caspase-3 protein and HSP70 protein in placenta tissue were increased with the increase of the severity of the pregnant women in the study group，the positive expression rates of caspase-3 protein and HSP70 protein in placenta of severe preeclampsia were significantly higher than those in mild preeclampsia（ 字2=9.91，7.93，P<0.01）.In the study group，the expression of HSP70 protein and the expression of caspase-3 protein were negatively correlated（r=0.582，P<0.01）.Conclusion：The abnormal expression of caspase-3 and HSP70 may not only be involved in the formation of preeclampsia，but also play an important role in the progression of the disease in patients with preeclampsia，and there may be interactions between them.

【Key words】 Preeclampsia； Caspase-3； HSP70； Vascular endothelial cell； Apoptosis

First-authors address：Shijie Hospital of Dongguan City，Dongguan 523290，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2016.36.023

子痫前期是妊娠期特有的疾病，母婴死亡率高，病因复杂，发病机制涉及到多系统、多器官的病理改变，迄今为止其病因和发病机制仍不明确[1]。大量研究资料发现，子痫前期早期发病已经出现胎盘血管内皮损伤，多数研究均认同胎盘血管内皮损伤和滋养层细胞功能障碍是子痫前期发病过程中的重要机制。caspase-3是半胱氨酸蛋白酶家族（caspase家族）中调节和参与凋亡发生的一种关键蛋白，其参与调整凋亡过程的机制可能与其被活化激活后具有切断天冬氨酸残基后肽键的能力有关[2-3]。HSP70是HSP家族中最保守和最主要的一类，在所有生物细胞中都有表达。近年来研究发现HSP70不仅是细胞有力的保护因子，还参与了细胞凋亡的过程，HSP70可与凋亡抑制因子（AIF）直接结合，从而抑制其介导的非caspase依赖性细胞凋亡[4]。同时有研究发现HSP70的高表达可增强了细胞抗凋亡能力，并可能通过下调细胞凋亡相关基因、蛋白和蛋白酶活性起到拮抗细胞凋亡的作用，因此HSP70被认为是凋亡抑制因子[5]。本研究通过应用免疫组织化学方法（SP法）检测45例子痫前期孕妇的胎盘组织中caspase-3、HSP70的表达情况和血管内皮细胞凋亡及其相关性，旨在为进一步研究子痫前期的发病机理奠定基础，为临床预防和治疗子痫前期患者提供一条崭新的方向和思路，现报告如下。endprint

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择本院收治住院的子痫前期孕妇45例为研究组，入选标准：单胎妊娠，行剖宫产终止妊娠，符合子痫前期诊断标准；排除标准：有多胎妊娠、高血压、心脏病、肾脏病、慢性肝病等病史以及输血和免疫治疗史的病例。子痫前期诊断标准参考第六版《妇产科学》，其中轻度子痫前期21例，重度子痫前期24例，平均年齡（30.26±5.65）岁，平均孕周（36.94±1.39）周。另选择同期本院收治的正常孕妇45例为对照组，平均年龄（29.19±4.05）岁，平均孕周（37.02±1.67）周。两组的年龄、孕周等一般资料比较，差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。本研究已经伦理学委员会批准，且患者均知情同意。

1.2 方法

1.2.1 试剂 SP法（streptavidin-perosidase，两步法）试剂盒购自福建迈新生物技术有限公司，caspase-3山羊抗人多克隆抗体（工作浓度1∶50）和兔抗人HSP70多克隆抗体均购自美国cell signal公司。

1.2.2 免疫组织化学染色 行剖宫产术后，收集研究组和对照组孕妇的胎盘组织标本，采用免疫组化SP法检测两组胎盘组织中caspase-3、HSP70的表达。操作程序：将收集的胎盘组织经10%中性缓冲甲醛溶液固定，常规脱水石蜡包埋后，制成石蜡切片，置于60 ℃烤箱内烘干60 min，常规脱蜡、脱水之后进行抗原修复（微波炉加热），缓冲液冲洗后置于3% H2O2中进行灭活，继续冲洗后滴加山羊血清工作液进行封闭，然后滴加caspase-3或HSP70抗体工作液，湿盒4 ℃过夜。缓冲液冲洗后滴加辣根酶标记链酶卵白素工作液，湿盒37 ℃孵育。缓冲液冲洗后采用DAB显色，光镜下观察。光镜下染色阳性结果判断：caspase-3定位于胞浆和胞膜内，HSP70定位于细胞胞浆，均呈黄色或棕色颗粒。每张切片随机选择检查5个视野，计数100个细胞，根据阳性细胞百分率数综合判定，计数阳性细胞数，计算阳性细胞率。<10%为阴性（-），10%～50%为（+），>50%为（++），（+）～（++）记为阳性。

1.3 统计学处理 应用SPSS 15.0版统计软件进行数据分析，计量资料用（x±s）表示，比较采用t检验；计数资料以率（%）表示，两指标之间的关系分析采用Spearson法，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组胎盘组织中caspase-3、HSP70蛋白的表达比较 研究组胎盘组织中caspase-3蛋白和HSP70蛋白的阳性表达率分别为62.2%、55.6%，均显著高于对照组的4.4%、11.1%，差异均有统计学意义（ 字2=11.65，9.37，P<0.01）。随着研究组孕妇的病情加重，胎盘组织中caspase-3蛋白和HSP70蛋白表达均呈上升趋势，重度子痫前期孕妇胎盘组织中caspase-3蛋白和HSP70蛋白的阳性表达率明显高于轻度子痫前期孕妇，差异均有统计学意义（ 字2=9.91、7.93，P<0.01），见表1。

2.2 caspase-3和HSP70表达的相关性 研究组中HSP70蛋白的表达和caspase-3蛋白的表达呈正相关（r=0.582，P<0.01）。

3 讨论

对子痫前期发病机制的研究一直是产科领域的热点问题，现在通过对胎盘组织中血管内皮细胞的变化及凋亡的机制研究，发现血管内皮细胞受损、结构及功能发生改变，甚至发生凋亡，可能是子痫前期发病至关重要的环节[6]。血管内皮细胞覆盖于血管内表面，隔开血管内血液和血管平滑肌，一旦它发生损伤或者凋亡，内皮细胞之间的间隙扩大，血液里的蛋白以及液体更容易渗透出血管，激活凝血系统发生DIC，同时进一步激活并释放血管活性因子和血管收缩因子，打破血管调节细胞因子之间的平衡，促进血管收缩的因子起主要作用，从而血压升高，全身各系统各脏器血液灌流量减少，最终导致器官病理改变，进一步促进子痫前期[7-8]。目前血管内皮细胞受损、结构及功能发生改变，甚至发生凋亡的具体机制仍然不清楚[9]。

caspase-3是caspase家族参与调控凋亡发生的关键凋亡执行者，参与外界各种刺激和诱因引发的细胞凋亡的过程。在caspase-3被刺激激活后，caspase-3能够发挥切断肽键的作用，降解细胞内重要的蛋白质，激发细胞凋亡的发生[10-11]。有研究结果提示，caspase-3的活化是血管内皮细胞凋亡信号传导通路的早期事件[12-13]，而Zhao等[14]的试验结果也提示了caspase-3调控的凋亡信号通路可能参与了血管内皮细胞的凋亡过程。Du等[15]实验中发现，在体外血管内皮细胞培养过程中发生血管内皮细胞凋亡时，可以检测到细胞内caspase-3表达量出现明显升高的情况；而Farber等[16]研究也同样是体外培养的血管内皮细胞实验，在应用caspase-3抑制剂后，发生血管内皮细胞发生凋亡数目减少。国内尹晓敏等[17]实验采用槟榔碱刺激血管内皮血细胞，检测到caspase-3表达和活性均出现显著上调现象，随之实验细胞出现大量凋亡。本研究结果也显示研究组胎盘组织中caspase-3蛋白的阳性表达率均显著高于对照组的表达，差异均有统计学意义（P<0.01）。提示caspase-3的异常表达可能参与了子痫前期的发生过程。随着研究组孕妇的病情加重，胎盘组织中caspase-3蛋白表达均呈上升趋势，重度子痫前期孕妇胎盘组织中caspase-3蛋白的阳性表达率明显高于轻度子痫前期孕妇（P<0.01），进一步证实了caspase-3蛋白表达上调不仅参与了子痫前期的发生，更可能是子痫前期患者病情演变和发展过程的作用机制之一[18]。

热休克蛋白是一组生物体受到各种刺激时产生的蛋白质分子，具有调节蛋白质的活性和功能、调控细胞的增殖与分化以及维持内环境稳定等重要生理功能。目前研究最多的是HSP70，研究结果提示HSP70是细胞有力的保护因子，它参与了细胞周期调控、增殖、凋亡、分化[19]。本研究结果发现研究组胎盘组织中HSP70蛋白的阳性表达率显著高于对照组的表达，差异有统计学意义（P<0.01）。随着研究组孕妇的病情加重，胎盘组织中HSP70蛋白表达均呈上升趋势，重度子痫前期孕妇胎盘组织中HSP70蛋白的阳性表达率明显高于轻度子痫前期孕妇（P<0.01）。说明HSP70的高表达不仅可能参与了子痫前期形成过程，而且也在子痫前期患者病情进展过程中发挥重要作用[20]。endprint

目前对于HSP70在细胞凋亡调控过程中的具体作用机制尚不明确，其与caspase-3蛋白表达之间的相互作用也仍不清楚。本研究结果显示，研究组中HSP70蛋白的表达和caspase-3蛋白的表达呈正相关（r=0.582，P<0.01）。因此，推测HSP70和caspase-3之间可能存在相互作用，HSP70可能通过影响caspase-3的表达及功能而参与细胞凋亡过程。因此，深入探讨二者在子痫患者胎盘组织中的表达及其作用机制，将对减缓子痫前期的形成及发展提供新的方向，具有重要的临床价值和应用前景。

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（收稿日期：2016-08-25） （本文编辑：张爽）endprint