紫花苜蓿根腐病原——厚垣镰刀菌的鉴定及其拮抗菌的筛选

柏玉晶，姚玉玲，张振粉，杨成德，薛莉

(甘肃农业大学植物保护学院，草业生态系统教育部重点实验室，甘肃省草业工程实验室，中-美草地畜牧业可持续发展研究中心，甘肃 兰州730070)

紫花苜蓿根腐病原
——厚垣镰刀菌的鉴定及其拮抗菌的筛选

柏玉晶，姚玉玲，张振粉，杨成德*，薛莉

(甘肃农业大学植物保护学院，草业生态系统教育部重点实验室，甘肃省草业工程实验室，中-美草地畜牧业可持续发展研究中心，甘肃 兰州730070)

采用常规组织分离法，对甘肃省武威市紫花苜蓿根腐病菌进行分离和致病性测定，并通过形态学特征和分子鉴定方法对致病性最强的菌株进行鉴定。结果表明，MXGF7可造成紫花苜蓿严重根腐，该病原菌大型分生孢子多纺锤形或镰刀形，大小为3.3～4.7 μm×14.8～32.0 μm；小型分生孢子少，纺锤形或哑铃形，大小2.9～4.2 μm×8.4～18.2 μm；ITS序列及镰孢菌Fu3/Fu4区基因序列分析表明，病原菌均与Fusariumchlamydosporum的相似度达99%，结合形态学特征将该病原菌鉴定为厚垣镰孢菌F.chlamydosporum。采用平板对峙法，从分离自东祁连山高寒草地牧草的123株内生细菌中筛选出61株菌株对F.chlamydosporum有拮抗效果，且抑菌率均在55%，并利用形态特征和16S rDNA基因序列分析将具有稳定拮抗作用265ZY3菌株鉴定为解淀粉芽孢杆菌Bacillusamyloliquefaciens。

苜蓿根腐病；厚垣镰孢菌；内生细菌；鉴定

紫花苜蓿(Medicagosativa)为优良的多年生豆科牧草，利用年限长，产草量高，营养好，再生性强，是畜牧业首选青饲料，有“牧草之王”的称号，在世界各国广泛种植[1]。但是，随着利用年限的增长，苜蓿根腐病发生日趋严重，已成为苜蓿栽培中的重要限制因素之一，其在美国、加拿大、澳大利亚、俄罗斯、日本和阿根廷等国家[2-4]及国内新疆、甘肃、青海和内蒙古等地均严重发生[5-8]。该病害为害苜蓿全生育期，使其固氮能力降低，植株衰弱，单产和品质下降；据估计每年全世界造成的产量损失在20%左右，严重发生的地块达到40%[9]。苜蓿根腐病的病原研究报道较多，但均主要认为由镰孢菌属真菌引起，如李敏权等[10]报道甘肃省中部干旱地区主要病原为尖孢镰孢(Fusariumoxysporum)、锐顶镰孢(F.acuminatum)和半裸镰孢(F.semitectum)；王多成等[11]报道，甘肃省张掖市引起苜蓿根腐病的病原是茄镰孢(F.solani)、串珠镰孢(F.moniliforme)和尖孢镰孢；潘龙其等[12]报道内蒙古赤峰市主要病原为拟枝孢镰孢菌(F.sporotrichioide)。镰孢属厚垣镰孢(F.chlamydosporum)可引起多种植物病害，如其可造成木耳的“白毛菌”病，导致木耳耳片霉烂[13]，还可以引起大豆根腐病[14]、阿尔及利亚地中海油松幼苗腐烂病[15]及番石榴的枯萎病[16]等，但该病原菌引起苜蓿根腐病的报道未见。本试验从甘肃省武威市苜蓿根腐病标本中分离获得一株致病镰孢菌，其形态与厚垣镰孢相似。因此，本试验利用形态学特征和分子方法对其进行了鉴定，并对其拮抗内生细菌进行了筛选和鉴定，以期为该病害的诊断和综合防治提供依据。

1 材料与方法

1.1 病原的分离与纯化

供试苜蓿根腐病样于2013年采自甘肃省武威市黄羊镇，实验室常规组织分离法分离病原菌，在PDA培养基(马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂17 g，蒸馏水1000 mL)上进行培养与纯化，待纯化的菌株产孢后进行单孢分离，进一步纯化后移入PDA斜面培养保存备用[17]。

1.2 致病性测定

离体试验：采用致伤接种法。将苜蓿播种于直径12 cm的塑料花盆中，在温度为20～30 ℃的室内培育植株至40 d苗龄时，选取健康的苜蓿，将分离物在PDA培养基上培养5 d后打成直径6 mm的菌饼接于伤口处，以无菌PDA培养基为对照，保湿48 h，25 ℃培养，3次重复，连续观察根部发病情况并记录数据，计算发病率。发病率(%)=总发病株数/总调查数×100。

浸根接种法：将苜蓿播种于直径12 cm的塑料花盆中，在温度为20～30 ℃的室内培育植株至40 d苗龄时，将根部稍加损伤，用浓度为106cfu/mL的孢子悬浮液浸根15 min，用无菌水浸根做对照，后移至花盆继续生长，3次重复，连续观察根部发病情况并记录数据，计算发病率。

形成典型症状后对发病植株进行再分离，按柯赫氏法则[17]确定致病菌。

1.3 病原菌的鉴定

1.3.1 形态学鉴定 将菌株接于PSA培养基25 ℃培养待产孢后，在显微镜下观察分生孢子、分生孢子梗及产孢细胞的形态特征；在40倍镜下分别测定大、小分生孢子、厚垣孢子大小(50个)，并在显微镜下拍照。根据病原菌形态特征，参照《真菌鉴定手册》[18]和《镰刀菌属》[19]等参考资料进行鉴定。

1.3.2 分子鉴定 DNA提取：将菌株接于PDA培养基于25 ℃下培养5～10 d后,刮取菌丝0.2 g于1.5 mL离心管中；加入混合均匀的螯合树脂150 μL，用电动组织研磨器充分研磨至菌丝成糊状、螯合树脂内的固体颗粒消失；再加入螯合树脂150 μL；沸水浴15～20 min；4 ℃,12000 r/min离心10 min，取上清液。经电泳检测将具有特异性条带的DNA提取物进行PCR扩增[20]。

利用ITS1(5′-CTT GGT CAT TTA GAG GAA GTA A -3′)、ITS4(5′-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3′)及镰孢菌特异性引物Fu3(5′-CCG AGT TTA CAA CTC CCA AA-3′)、Fu4(5′-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3′)对病原菌基因组DNA进行PCR扩增[21]。两种引物均由华大生物工程有限公司合成。其扩增体系均为：2×MasterMix 25 μL,引物各3 μL，DNA模板2 μL(以加2 μL双蒸水为空白对照)，最后用双蒸水定容到50 μL。扩增程序为：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30个循环；最后72 ℃延伸10 min。PCR扩增产物用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测后，具特异性条带的产物送华大生物工程有限公司测序。将测序结果与GenBank中的相关序列进行同源性比较，明确其种类。

1.4 拮抗内生细菌的筛选及鉴定

1.4.1 拮抗内生细菌的筛选 采用平板对峙培养法[17]。以东祁连山高寒草地牧草的根、茎、叶部分离的126株内生细菌为供试拮抗菌(由甘肃农业大学草业学院微生物多样性实验室提供)，将病原真菌置于PDA培养基上活化培养5 d后打成直径 6 mm的菌饼，接种在PDA培养基中央，内生拮抗菌经24 h活化培养后点接在距菌饼2.5 cm处，每平板4点，以点接无菌水为对照，25 ℃培养，3次重复，待对照病原真菌长满培养皿后测量处理菌落直径(cm)，以抑菌率表示内生细菌的抑菌能力。抑菌率(%)=(对照菌落直径-处理菌落直径)/对照菌落直径×100。

1.4.2 形态学鉴定 将优良拮抗菌株于NA平板划单菌落，28 ℃培养3 d后观察并描述单菌落形态特征；在NA平板上培养24 h后进行革兰氏染色，并测量菌体大小(30个)和显微照相[17]。

1.4.3 16S rDNA序列分析 用细菌基因组DNA抽提试剂盒(上海生物工程有限公司，Ezup柱式基因组细菌DNA抽提试剂盒)提取病原菌的基因组DNA。采用通用引物27f(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和 1492r (5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)[22]扩增拮抗菌株的16S rDNA。其扩增体系为：10×buffer 5 μL，MgCl2(25 mol/L)3 μL，dNTP(5 mmol/L)1 μL，TaqDNA聚合酶(5 U/μL)0.5 μL，引物1(10 μmol/L)1 μL，引物2(10 μmol/L)1 μL，模板DNA 1 μL(以加1 μL双蒸水为空白对照)，最后用ddH2O定容到50 μL。PCR扩增程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min，48 ℃退火30s，72 ℃延伸1 min，循环32次；72 ℃下延伸8 min。 PCR产物用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测后，具特异性条带产物送华大生物工程有限公司进行测序，将测序结果与GenBank中的相关序列进行同源性比较，明确其种类。

2 结果与分析

2.1 田间症状

发病初期苜蓿根及根颈部产生褐色坏死斑，根部横切发现维管束呈棕色，随后病斑逐渐扩大，最后呈现严重腐烂变为深褐色及黑色，维管束腐烂呈中空；地上植株生长缓慢，叶片变黄枯萎,最后植株死亡(图1)。

2.2 病原菌的分离及其致病性测定

从多个发病根部进行常规分离法、单孢纯化，得到8个真菌分离物(图2)，其培养性状、菌丝形态、孢子形态各不相同，并将8个分离物依次编号为MXGF1、MXGF2、MXGF3、MXGF4、MXGF5、MXGF6、MXGF7和MXGF8。对其进行致病性测定发现离体接种8株菌株的苜蓿根部全部发病；浸根接种后MXGF2’、MXGF4’、MXGF6、MXGF7、MXGF8发病率100%，MXGF2发病率75%，MXGF4、MXGF5发病率50%。

离体致病性试验表明，接种部位深褐色、腐烂，表面产生白色霉层，剖开发病部位，根部维管束向内变为褐色(图3B)，与田间症状一致，对照无症状(图3A)。将苗龄为40 d的苜蓿根用浓度为106cfu/mL的孢子悬浮液浸根15 min后移至花盆继续培养，30 d后，叶片由外向内逐渐枯黄，后地上部分开始萎蔫；根部致伤部位先出现水渍状坏死斑，后病斑扩大颜色变为褐色、深褐色(图2)，发病严重的腐烂部位变为黑色且凹陷变空(图2H)；根颈及根颈部分节处呈褐色、红褐色至黑色腐烂病斑(图3D)，对照无症状(图2A、图3C)。

2种方法从发病部位再分离均可得到与原接种真菌相同的分离物，根据柯赫氏法则，确定8株菌株均为苜蓿根腐病的致病菌。其中根据发病程度发现，MXGF7菌株的病斑明显大，且发病严重于其他菌株(图2H)，所以对MXGF7做了后续研究。

2.3 病原菌的鉴定

2.3.1 形态学鉴定 25 ℃培养5 d后，菌落长满培养皿。菌落圆形，绒毛状，初生菌丝奶白色，后略带黄色，气生菌丝发达(图4A)，培养基背面由内向外呈黄棕色至淡黄色(图4B)。7 d左右开始产生分生孢子。产孢细胞单瓶梗,大小2.3～7.0 μm×6.8～17.5 μm(图4C)。

图1 苜蓿根及根颈腐烂病症状Fig.1 Symptoms of alfalfa rot on crown and root

小型分生孢子少，纺锤形或哑铃形，0～1隔，大小8.4～18.2 μm×2.9～4.2 μm。大型分生孢子多纺锤形或镰刀形，两端钝、基部具足跟(图4D)或细长、两端逐渐变尖、基部具脚泡(图4E)，多3～5隔，3隔孢子大小14.8～29.6 μm×3.3～4.5 μm，5隔孢子大小24.53～32.0 μm×3.8～4.7 μm。厚垣孢子圆形，间生或串生，直径 7.2～29.3 μm(图4F)。参考相关文献[18-19]，根据形态特症初步鉴定该菌株为厚垣镰孢菌F.chlamydosporum。

图2 浸根接种苜蓿根部发病情况Fig.2 The smptoms on alfalfa root by dipping root inoculation A:对照Contrast; B:MXGF2; C:MXDF2’; D:MXGF4; E:MXGF4’; F:MXGF5; G:MXGF6; H:MXGF7; I:MXGF8.

图3 MXGF7致病性测定Fig.3 Pathogenicity test of the pathogen of MXGF7 A：根部横切对照；B：根部横切发病症状；C：根颈部对照；D：根颈部发病症状。A: The crosscutting control of root; B: The crosscutting symptoms of root; C: The control of root crown; D: The symptoms of root crown.

2.3.2 分子鉴定 利用引物ITS1、ITS4和Fu3、Fu4分别对病原菌基因组DNA进行PCR扩增，扩增产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳检测，以DNA Marker-DL2000为对照，具特异性条带的扩增产物送往华大生物工程有限公司测序，将测序结果在GenBank中进行同源序列比较，下载相似性高的序列，并用Mega(5.0)软件采用邻接法构建系统发育树。结果显示，ITS基因扩增序列为528 bp，与F.chlamydosporum(KT211539.1)相似度达99%，在系统发育树上聚在一起(图5)；引物Fu3/Fu4扩增序列509 bp，在GenBank中经同源序列比较发现其与F.chlamydosporum(HQ654898.1)的同源性在99%以上，且在系统发育树上与其聚在一起(图6)，即二者亲缘关系最近。结合形态特征，将该病原菌鉴定为厚垣镰孢菌F.chlamydosporum。

2.4 拮抗内生细菌的筛选与鉴定

图4 病原菌形态特征Fig.4 Morphological characters of the pathogens A：菌落正面；B：菌落背面；C：产孢细胞；D～E：大型分生孢子；F：厚垣孢子。A:Upper surface of the colony; B: Reserved surface of the colony; C: Conidiogenous cell; D-E: Macroconidia of the pathogen; F:Chlamydospore.

图5 基于ITS基因序列的系统发育树Fig.5 Phylogrnetic tree based on ITS gene sequence

2.4.1 拮抗内生细菌的筛选 经平板对峙培养表明，分离自高寒草地123株细菌中有61株对厚垣镰孢菌有拮抗效果，且抑菌率均在55%以上，其中菌株263AG5′抑菌能力最强，抑菌率达69.93%，其次为菌株263ZY1、263XY1、261AY3，其抑菌率分别为69.35%、69.26%和69.23%(表1)。

图6 基于镰孢菌专用引物Fu3/Fu4扩增序列的系统发育树Fig.6 Phylogrnetic tree based on the Fu3/Fu4 specificity sequence of pathogenic fungus表1 部分内生细菌对厚垣镰孢菌的抑菌能力测定(抑菌率65%以上)Table 1 Inhibition rate of endophytic bacteria on Fusarium chlamydosporum(more than 65% antibacteria ratio)

拮抗菌株Antagonisticstrains处理菌落直径Treatingcolonydiameter(cm)抑菌率Antifungalratio(%)拮抗菌株Antagonisticstrains处理菌落直径Treatingcolonydiameter(cm)抑菌率Antifungalratio(%)CK18.17a0.00d262AY83.03bcd66.00ab263ZY23.22b64.57bc265ZG32.95cd67.11ab263ZY43.10c66.09bcCK57.65a0.00b263ZY12.85e69.35a261AG32.82bc67.60ab261ZG142.92d68.48ab261AG92.87bc66.90ab263ZG53.17bc65.22cASZ42.78bc68.07ab264ZY103.10c66.09bc针2Zhen22.95b65.73ab263ZG93.10c66.09bc263AG5'2.65e69.93aCK27.62a0.00a261AY72.93b65.97ab262XY6'2.87bc66.75b261AY3'2.77bc68.30ab262XY12.88b66.51b261MY62.83bc67.37ab265ZY62.80c67.68b262AG62.82bc67.60abCK37.98a0.00c264AY12.87cd66.90ab265XG73.12b65.03b261AY32.70de69.23a263XY12.80c69.26aXSG42.80cd67.83ab262XY2'3.05b65.92b线3Xian32.78bc68.07abCK47.95a0.00c针1Zhen12.80cd67.83ab262AY63.10b65.10abCK67.57a0.00b265XY43.10b65.10ab矮2Ai22.80b67.45a265AG133.03bc66.00b矮3Ai32.82b67.22a265ZY32.92cd67.56a矮4Ai42.88b66.28a265ZY22.97cd66.89ab264ZY72.8267.22a263XY32.90cd67.79a---

注：小写字母表示在P<0.05水平差异显著。

Note: Lowercase letters is significantly atP<0.05 level.

2.4.2 内生拮抗细菌对病原菌菌丝及孢子的影响 厚垣镰孢菌正常菌丝呈淡黄褐色，菌丝均匀光滑，锐角分支，有隔膜，分支和隔膜处均有隘缩(图7,CK-2)；大型分生孢子镰刀形，细胞壁均匀光滑，有明显隔膜，隔膜处有隘缩。受拮抗细菌影响的菌丝颜色变深，菌丝或膨大变粗或变细，粗细不均匀，隔膜消失或变得不明显(图7,263XY1-2)，膈膜间膨大呈球形，菌丝呈念珠状(图7,263AG5’-2)，有的菌丝中间出现泡状物(图7,261AY3-2)；分生孢子隔膜消失，孢子体中间出现许多泡状物，有的孢子壁变形不光滑呈波浪状，有的孢子出现严重不规则变形。

2.4.3 形态学鉴定 经抑菌、溶磷、固氮和产吲哚乙酸能力综合筛选，获得功能性良好的菌株265ZY3，并对其进行鉴定。将265ZY3在NA培养基上28 ℃培养3 d，菌落大小为0.5～1.0 cm，不规则形，边缘呈波状，表面褶皱，干燥，中间向上隆起，圆形，奶白色(图8A)；革兰氏染色呈阳性，杆状(图8B)，菌体大小为0.36～0.77 μm×1.18～3.04 μm。

2.4.4 16S rDNA序列分析 经电泳检测对具有特异性条带的DNA样品用引物27 f和1492 r进行PCR扩增，以DNA Marker-DL2000为对照，在1500 bp附近有一条明显的扩增条带。测序后所得rDNA-ITS序列为株265ZY3与GenBank中菌株B.amyloliquefaciens(KF831366.1)的相似性为100%，与其他菌株的相似性均在99%以上，下载相似性较高的序列，并用Mega(5.0)软件采用邻接法构建系统发育树，该菌株与解淀粉芽孢杆菌B.amyloliquefaciens(KF831366.1) 聚在一起(图9)，即与其亲缘关系最近，结合形态学特征，鉴定其为解淀粉芽孢杆菌Bacillusamyloliquefaciens。

图7 3株拮抗细菌对病原菌菌丝的影响Fig.7 Effect of antagonistic strains to mycelium

1455 bp。经在GenBank中进行同源序列比较，表明菌

图8 265ZY3单菌落(A)与革兰氏染色(B)Fig.8 A single colony (A) and gram staining (B) of 265ZY3

图9 265ZY3菌株的16S rDNA系统发育树Fig.9 16S rDNA phylogenetic tree of strain 265ZY3

3 讨论

3.1 苜蓿根腐病的研究

最早研究苜蓿根和根颈腐病的学者是 Cormack，他对加拿大他亚伯达Abert苜蓿根部寄生真菌进行了研究，明确了锐顶镰孢，燕麦镰孢菌(F.avenaceum)和立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani)在苜蓿中的寄生情况[23]。苜蓿根腐病是一种典型的土传病害，病原种类较多，先后报道的该病病原已达29种，其中镰孢菌14种，细菌2种，线虫1种，其他病原菌12种[24,12]。目前国内外已报道的镰孢菌有：尖孢镰孢、燕麦镰孢菌(F.avenaceum)、茄镰孢、锐顶镰孢、黄色镰孢菌(F.culmorum)、三线镰孢菌(F.tricinctum)、接骨木镰孢菌(F.sambucinum)、链状镰孢菌 (F.fusarioides)、木贼镰孢菌(F.equisti)、半裸镰孢、串珠镰孢、大刀镰孢菌(F.Culmorum)、梨孢镰孢菌(F.poae)和拟枝孢镰孢菌。2001年我国陈雅君等[25]对黑龙江省紫花苜蓿进行了根腐病研究，确定了优势致病菌为镰孢菌和丝核菌；李敏权等[10]和王多成等[11]报道甘肃省苜蓿根腐病的病原有尖孢镰孢、锐顶镰孢、半裸镰孢、茄镰孢和串珠镰孢；王兰英等[26]对苜蓿根腐病原菌茄镰孢、尖孢镰孢和燕麦镰孢进行了生防放线菌的分离与筛选；丁守彦等[27]做了不同品种苜蓿对镰孢菌的抗性鉴定研究。本试验分离鉴定的厚垣镰孢菌所致苜蓿根腐病是国内首次报道。

3.2 镰孢菌的鉴定方法

大多数菌物种类多，形态特征复杂，其形态除了受遗传物质的控制外，还受环境的影响，其部分形态特征和生理生化指标会随着培养条件的变化而不稳定，因此物种鉴定还极大的依赖于研究者的经验。本试验观察到F.chlamydosporum在PDA培养基上和PSA培养基上孢子大小存在明显差异，PDA上的分生孢子较小。研究资料表明，依据真菌形态特征进行分类鉴定受多种因素的影响，例如镰孢菌的产孢条件难以摸索[28]，并且菌物形态上的相似性和许多有性态的未知性，通过培养性状及表型鉴定很难将其在种级水平上分类，所以菌物的准确鉴定还必须结合现代分子生物技术，提高试验结果的准确性。长期以来所采用的rDNA-ITS鉴定在真菌分类和发育系统中广泛应用，王晓英等[29]又结合镰孢菌rDNA 18S、5.8S、28S及其区间ITS1和ITS2序列设计了镰孢菌专用引物Fu3/Fu4，其区间序列表达和调控十分保守，可以较好的表现镰孢菌在种一级的关系，近几年在镰孢菌的鉴定上得到了广泛的应用。刘文波等[30]利用ITS区的不同引物对香蕉枯萎病菌的遗传多态性进行了研究，也进一步证明了引物的特异性。所以，为了提高物种鉴定的准确性，应进一步扩大分子鉴定方法在菌物鉴定中的研究和应用，并综合各方面的资料和研究者的经验，以克服单一方法的局限性。

3.3 苜蓿根腐病的生物防治

苜蓿根腐病为土传性病害，在苜蓿生长的各个时期只要条件适宜，土壤中的病原均可以侵染寄主，致防治困难。近年来植物内生细菌对病原菌的拮抗作用成为人们关注的热点，对其做了广泛的研究并取得了良好的效果。内生细菌广泛存在于植物体内[31]，其中芽孢杆菌属(Bacillus)、假单胞菌属(Pseudomonas)和肠杆菌属(Eterobacter)内生细菌最为常见[32]。内生细菌可以通过诱发植物自身的抗病潜能而增强植物的抗病性，其自身还可以合成多种物质来促进植物生长，产生多种代谢产物来抑制植物病原菌生长，且其存在于宿主体内，可以长期发挥作用，相对于其他生防因子有独特的优势，可能会对防治困难的土传根腐病有更好的防治作用。Bacon等[33]分离的玉米内生枯草芽孢杆菌与玉米病原真菌串珠镰孢有相同的生态位，枯草芽孢杆菌能在玉米体内迅速定殖，可有效降低串珠镰孢毒素的积累。郭荣君等[34]利用营养竞争平板筛选法，筛选到2株可完全抑制尖孢镰孢和茄镰孢菌丝生长的枯草芽孢杆菌，对真叶期大豆根腐病有很好的防治效果。本试验从高寒草地牧草内生细菌中筛选了该病原菌的拮抗细菌并进行了鉴定，以期为其生物防治提供菌种资源，但该研究仅在室内进行了抑菌试验，还需对其抑菌机制、拮抗细菌的定殖动态及其防效等进一步研究，为研制对苜蓿根腐病具有良好防治效果的生物菌肥制剂奠定基础。

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Identification of alfalfa root rot caused byFusariumchlamydosporumand screening of antagonistic bacterial strains

BAI Yu-Jing, YAO Yu-Ling, ZHANG Zhen-Fen, YANG Cheng-De*, XUE Li

CollegeofPlantProtection,GansuAgriculturalUniversity,KeyLaboratoryofGrasslandEcosystem,MinistryofEducation,PrataculturalofGansuProvince,Sino-U.S.CenterforGrazinglandEcosystemSustainability,Lanzhou730070,China

To identify the causal pathogens of alfalfa root rot with strong pathogenicity, pathogens were isolated from alfalfa (Medicagosativa) plants with alfalfa root rot growing in Wuwei City, Gansu Province. The pathogens were identified based on their morphology and by molecular methods. The results showed that the strain MXGF7 caused acute root rot of alfalfa. Most of its macroconidia were fusiform or sickle-shaped (3.3-4.7 μm×14.8-32.0 μm), and its microconidia were fusiform or dumbbell-shaped (2.9-4.2 μm×8.4-18.2 μm). The ITS sequence and the Fu3/Fu4 specificity gene sequence of the pathogenic fungus shared 99% similarity with those ofFusariumchlamydosporum, and so the pathogenic fungus was identified asF.chlamydosporum. We isolated 123 endophytic bacterial strains from alpine grassland in the Eastern Qilian Mountains, and evaluated their ability to antagonize the pathogenic strain ofF.chlamydosporum. Sixty-one of the bacterial strains showed an antifungal ratio greater than 55%. The most antagonistic bacterium, strain 265ZY3, was identified asBacillusamyloliquefaciensbased in its morphology and 16S rDNA gene sequence.

alfalfa root rot;Fusariumchlamydosporum; endophytic bacteria; identification

10.11686/cyxb2016111

http://cyxb.lzu.edu.cn

2016-03-14；改回日期：2016-04-19

国家自然科学基金(No.31460639),草业生态系统教育部重点实验室(甘肃农业大学)开放课题项目(CYzs-2011011),甘肃省农牧厅科技支撑项目和甘肃省自然科学基金(145RJZA130)资助。

柏玉晶(1989-), 女, 甘肃白银人, 硕士。E-mail: 1345491709@qq.com

*通信作者Corresponding author. E-mail:yangcd@gsau.edu.cn

柏玉晶, 姚玉玲, 张振粉, 杨成德, 薛莉. 紫花苜蓿根腐病原——厚垣镰刀菌的鉴定及其拮抗菌的筛选. 草业学报, 2017, 26(2): 78-87.

BAI Yu-Jing, YAO Yu-Ling, ZHANG Zhen-Fen, YANG Cheng-De, XUE Li. Identification of alfalfa root rot caused byFusariumchlamydosporumand screening of antagonistic bacterial strains. Acta Prataculturae Sinica, 2017, 26(2): 78-87.