牙龈卟啉单胞菌调控细胞自噬的分子机制研究进展

赵妍 于阳 寇育荣,

1.中国医科大学附属口腔医院牙周科；2.口腔生物学教研室，沈阳 110002

牙龈卟啉单胞菌调控细胞自噬的分子机制研究进展

赵妍1于阳2寇育荣1,2

1.中国医科大学附属口腔医院牙周科；2.口腔生物学教研室，沈阳 110002

细胞自噬是细胞内一种保守的降解代谢途径，是宿主防御细菌感染的关键步骤。牙龈卟啉单胞菌（P. gingivalis）作为一种牙周致病菌，能够利用其引发的细胞自噬实现其在宿主细胞内的生存和增殖，从而逃避宿主的免疫监视。本文就P. gingivalis内化并调控各种宿主细胞发生自噬的分子机制作一综述，从而深入探讨P. gingivalis的致病作用，并拓展P. gingivalis与全身疾病关系的研究思路。

牙龈卟啉单胞菌； 细胞自噬； 血管内皮细胞； 牙龈上皮细胞

细胞自噬是细胞内一种保守的降解代谢途径，是宿主防御细菌感染的关键步骤。牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis，P. gingivalis）是目前公认的牙周致病菌之一。该菌具有很强的细胞侵入能力，能够内化于牙龈上皮细胞、牙龈成纤维细胞以及血管内皮细胞、血管平滑肌细胞、肝细胞、巨噬细胞和树突状细胞等宿主细胞[1-6]。进入细胞内的微生物可以利用各种各样的策略实现其在胞内的滞留并维持细胞生存状态，从而逃避宿主的免疫应答。近年来的研究[7]表明，P. gingivalis可影响细胞自噬途径从而实现其在宿主细胞内的长期存活。本文将着重探讨P. gingivalis的内化过程及其所诱导细胞自噬的分子机制，从而进一步深化P. gingivalis的致病机制。

1 P. gingivalis内化于宿主细胞

1.1 P. gingivalis的黏附与内化

众所周知，病原微生物和宿主细胞之间的相互作用导致了感染性疾病的发生。目前多认为，P.gingivalis的菌毛通过与整合素蛋白α5β1相结合实现其对细胞的黏附，是P. gingivalis内化于宿主细胞的初始步骤[8]。然后P. gingivalis通过胞吞进入细胞，即由细胞表面伸出伪足将细菌捕获入胞，这一由胞外到胞内的穿膜过程借助脂筏实现[7,9]。P. gingivalis与整合素相结合引起整合素相关的下游信号转导分子在亚细胞水平活化和定位，焦点黏附蛋白和焦点黏附激酶磷酸化并从胞浆聚集到胞膜周围，形成焦点黏附复合体，使肌动蛋白丝在牙龈上皮细胞表面核化形成钉状突起。焦点黏附复合体的形成破坏了肌动蛋白和微管蛋白的动力学平衡，促进了特异靶向性胞内信号的传递，最终导致细胞骨架的重排和P. gingivalis的内化[10-11]。

P. gingivalis的黏附能力与P. gingivalis的菌株及其毒力有关[12-13]，菌株W83和381对人冠状动脉内皮细胞表现出相同的黏附力，并且比菌株A7436和ATCC33277的黏附力更强。另一方面，P. gingivalis牙龈素基因失活可使其对牙龈上皮细胞的黏附能力有所下降，因此P. gingivalis牙龈素在该菌的黏附与内化过程中也起到重要作用[14]。

1.2 内化的P. gingivalis的胞内运输途径

胞内微生物的致病过程一般分为4个步骤：进入、存活、繁殖和逃逸[15]。P. gingivalis在感染细胞内如何转运尚不完全清楚。P. gingivalis内化于宿主细胞后，可能存在3种运输途径。一是进入初级内体（early endosome）中，此后直接运输至溶酶体而降解；二是从初级内体进入自噬途径；另外还有一些P. gingivalis可逃出内体经再循环途径而出胞[3]，通过肌动蛋白微丝形成的膜突实现细胞与细胞间的传播，或进入更深层的宿主组织，达到持续感染的目的[1,16]。

2 细胞自噬

自噬是细胞自身降解陈旧蛋白、细胞器，回收利用氨基酸、核酸等小分子以实现自身代谢需要和某些细胞器更新的过程，对于细胞生长及维持稳态发挥着重要作用[17]。在营养缺乏、低氧、DNA损伤、电离辐射、病原体侵入等特殊环境下[18-19]，自噬可以通过与凋亡不同的降解机制（膜包被降解）和分子机制（特定基因的激活），使细胞程序性死亡。同时，自噬也参与了人体许多疾病的发生，如癌症、肌功能损伤、神经性疾病和病原体感染等[20]。自噬是一把“双刃剑”，既能参与宿主抵御病原菌感染的过程，使侵入细胞的细菌通过脂筏介导的胞吞作用被运送至溶酶体而降解[21]；也可以成为某些病原菌逃避免疫监视的独特策略，促进入胞细菌的存活、增殖及感染的迁延[3]。

细胞内的自噬过程分为以下几个阶段。1）首先在自噬的启动阶段，在ULK1（Unc-51-like kinase）蛋白酶复合体、PI3K（phosphatidylinositol 3-kinase）复合体Beclin-1-Vps34等分子的共同作用下，细胞胞浆中会出现大量游离的膜性结构，即自噬前体（preautophagosome）。该膜性结构目前多认为来源于粗面内质网的内陷，也可能源于高尔基体或线粒体膜等。2）前自噬体在由自噬相关基因（autophagy associated gene，ATG）5与ATG12形成的泛素样共轭体和由微管相关蛋白轻链3（microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3）与脂质磷脂酰乙醇胺（lipid phosphatidylethano-lamine，PE）形成的泛素样共轭体的参与下逐渐延伸，形成双层膜性结构空泡，即自噬体（autophagosome），并吞入部分胞浆、变性坏死的细胞器以及侵入胞内的病原体，此为自噬体成熟阶段[22]。3）随后自噬体外膜与溶酶体膜融合，自噬体内膜及其内部包裹的物质进入溶酶体腔，形成自噬溶酶体（autolysosome）。4）最后吞噬物被溶酶体酸性水解酶消化分解，自噬溶酶体随后进入自身代谢循环[23]。

3 P. gingivalis诱导细胞自噬

脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是P. gingivalis细菌表面的重要毒力因子之一。LPS的脂质A成分能够被人类多种细胞表面的模式识别受体（pattern recognition receptors，PRRs），如Toll样受体（Tolllike receptors，TLRs）所识别，二者的相互作用引起宿主细胞中炎症反应的产生。除了激活炎症反应外，宿主也可以上调胞内降解途径，如自噬来达到清除病原菌的目的。同时，一些内化于胞内的细菌在自噬途径中可抑制自噬体的成熟或延缓自噬体与溶酶体的融合，使细菌在胞内得以生存和增殖。胞内P. gingivalis的定位可能因宿主细胞类型不同而异，P. gingivalis可位于不同的细胞器，如细胞质、内体和自噬体中[24]。利用宿主自噬途径逃避固有免疫是P. gingivalis在宿主体内持续存在的一种独特策略，而P. gingivalis在自噬途径中的运输因宿主细胞类型而异。

3.1 口腔来源细胞

3.1.1 牙龈上皮细胞 P. gingivalis作为牙周致病菌红色复合体中的重要成员，能内化进入牙龈上皮细胞并引起牙龈炎症的现象已基本阐明，但该菌在胞内的生存策略尚不清楚。研究[23]表明，自噬抑制剂渥曼青霉素能显著减少牙龈上皮细胞中P. gingivalis的数目，表明自噬可能有助于胞内P. gingivalis的存活。Takeuchi等[23]观察到，内化于牙龈上皮细胞中的P. gingivalis进入初级内体中，约50%的细菌随后进入含细胞溶解酶的细胞器中，如自噬溶酶体或溶酶体。同时，胞内其他的P. gingivalis进入Rab11（Rasrelated protein in brain 11）和RalA（Ras-related protein Ral-A）阳性的循环内体而出胞，传递至相邻的健康细胞，造成感染的散播和持续存在。这些结果表明，P. gingivalis在牙龈上皮细胞中可能存在3种运输途径，即自噬、溶酶体及再循环途径。吞噬细胞中溶酶体的成熟需要自噬蛋白LC3与黑素曲菌素（melanoregulin，MREG）相结合，因而MREG介导的LC3依赖性的降解途径是清除细菌的必要过程，Frost等[25]在P. gingivalis感染的巨噬细胞中观察到了二者的结合。Blasi等[26]在重度牙周炎患者的牙龈上皮细胞中观察到自噬蛋白LC3与MREG的重新分布，二者呈现一定程度的共定位，而在轻度牙周炎及健康人群中分离的牙龈上皮细胞中则观察不到这一现象。定量分析显示健康人牙龈上皮细胞中的LC3Ⅱ水平高于牙周炎患者，同时牙周炎患者的MREG与Beclin水平降低至基线水平的50%，因而推测牙周炎患者牙龈上皮细胞中的P. gingivalis感染可能影响了MREG和（或）LC3的表达，抑制了正常的自噬过程，导致P. gingivalis在胞内的清除减少从而引起慢性牙周炎的产生。

3.1.2 牙龈成纤维细胞 P. gingivalis引起的牙龈成纤维细胞的免疫炎症反应在牙周炎结缔组织丧失中起着重要的作用。以P. gingivalis外膜的LPS刺激牙龈成纤维细胞，ATG12和LC3的mRNA水平显著升高，ATG12的蛋白水平及LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的转变也显著提高，表明P. gingivalis外膜LPS可以促进自噬体的形成。自噬本身是一种通过清除损伤细胞器实现自我更新的过程，因而自噬可能有助于清除受损的线粒体。线粒体是所有真核细胞代谢能源的主要来源，对于细胞自稳态的维持有着重要的作用，线粒体损伤将导致线粒体源活性氧（reactive oxygen species，ROS）的产生增多。电子显微镜下可以观察到经P. gingivalis外膜LPS处理的牙龈成纤维细胞中的自噬体能吞入部分线粒体引起线粒体的降解。同时，免疫荧光检测也观察到自噬蛋白LC3与线粒体标记物细胞色素C共定位。加入抗氧化剂后，线粒体ROS和胞内自噬泡有所减少。因此，P. gingivalis外膜LPS引发的细胞氧化应激反应可能诱导了细胞自噬的产生[2,27]。此外，由自噬抑制剂处理后，P.gingivalis外膜LPS处理过的牙龈成纤维细胞中自噬泡形成减少，并伴细胞活性显著降低和细胞凋亡率的升高，表明LPS引起的自噬对细胞具有一定的保护作用。

3.2 全身其他来源细胞

3.2.1 血管内皮细胞 流行病学证据表明牙周疾病与心血管疾病之间有着潜在的联系。在动脉瘤、血栓及动脉粥样硬化斑块的标本中能检测出P. gingivalis的DNA或直接分离出活菌；因此P. gingivalis能促进动脉粥样硬化的形成，并且可以增加心肌梗死后心脏破裂发生的概率[28]。实验研究[1]证明，P. gingivalis能够侵入血管内皮细胞以实现胞内滞留、逃避宿主清除并传播感染。内化的P. gingivalis可以激活胞浆型的自噬标志蛋白LC3-Ⅰ向膜型的LC3-Ⅱ转变，并增加Beclin-1的表达及ATG5与ATG12的结合，继而激活细胞自噬。侵入血管内皮细胞的P. gingivalis在感染25～35 min时位于含Rab5的初级内体中，30～90 min时进入早期自噬体中[29]。随后，大多数内化的P. gingivalis进入含有溶酶体相关膜蛋白（lysosomeassociated membrane protein，LAMP）1的晚期自噬体中，仅少量细菌与自噬溶酶体的组织蛋白酶共定位。其可能的原因正是P. gingivalis利用了细胞自噬机制，通过延缓自噬体与溶酶体的融合或改变正常的自噬转运过程而阻止自噬体向自噬溶酶体的成熟，分解利用自噬体所包裹的蛋白质而定植在晚期自噬体内，进而逃脱被溶解的结局而逃出细胞外[3,8,30]。Rodrigues等[12]对比了P. gingivalis的W83、A7436、381、ATCC 33277这4种菌株在人冠脉内皮细胞黏附、内化和生存的能力，结果显示不同菌株在人冠脉内皮细胞内的运输途径及致病机制各不相同。仅W83和381菌株在胞内被运至自噬体，其中W83是唯一有赖于自噬在胞内得以生存的菌株。而菌株ATCC 33277大多数由内体运到溶酶体而降解，菌株A7436则进入胞内再循环途径。

3.2.2 肝细胞 近年来有研究表明，P. gingivalis的感染可以加速非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）的发展。Zaitsu等[4]发现内化进入肝细胞内的P. gingivalis主要定位于LAMP2阳性的溶酶体中，部分与自噬蛋白LC3共定位。脂滴的存在能够促进感染早期（0～6 h）P. gingivalis在人肝癌细胞模型中的存活。此外，使用共聚焦显微镜可以观察到脂滴能够使感染细胞内的自噬体的形成有所减少。因而脂滴的累积可以通过抑制溶酶体及自噬溶酶体的形成而延缓肝脂肪变性的肝癌细胞中的P. gingivalis清除，进而引起细胞内持续的炎症及细胞损伤，成为NAFLD发生发展过程中的危险因素之一。

3.2.3 巨噬细胞 Park等[5]用P. gingivalis感染巨噬细胞初步阐明了P. gingivalis与自噬及炎症三者相联系的机制。加热灭活的P. gingivalis仍能引起LC3-Ⅱ水平的增加，因而致炎因子LPS可能是介导P. gingivalis引起宿主细胞自噬的成分。P. gingivalis进入巨噬细胞后，炎症小体NLRP3（NLR family pyrin domain containing 3）与AIM2（absent in melanoma 2）识别P. gingivalis在宿主细胞中的产物而激活半胱天冬酶1，从而使重要的促炎症因子白细胞介素（interleu-kin，IL）-1家族中的 IL-1β和IL-18成熟并释放。P.gingivalis在巨噬细胞中引起的自噬却能够通过胞外信号调节酶抑制胞内过多IL-1β的产生，同时，自噬可以降解一部分的病原菌，形成dsDNA产物，炎症小体AIM2可识别这种产物引起炎症反应[31]。自噬与炎症就是这样相互影响的两个过程，参与慢性炎症性疾病的发生和发展。

3.2.4 树突状细胞 树突状细胞（dendritic cells，DCs）是机体功能最强的抗原提呈细胞，处于启动、调控、维持免疫应答的中心环节，因而对胞内病原菌的转归至关重要。DCs表面的PRRs包括TLRs和C型凝集素受体，P. gingivalis对PRRs的初始识别决定了P. gingivalis在DCs中不同的运输途径[32]。DCs可以利用自噬和溶酶体途径来清除胞内P. gingivalis。DCSIGN（DC-specific intercellular adhesion molecule-3 grabbing non-integrin）是C型凝集素受体的一种，El-Awady等[33]观察到，只表达短菌毛蛋白（minor fimbrial protein，Mfa）1的P. gingivalis靶定DC-SIGN进入DCs后存在于单层囊泡中，并使LC3-Ⅱ、LAMP1减少，逃避自噬及溶酶体途径，有利于P. gingivalis在胞内持续存活。TLR2的激活却能抑制这种作用，因此同时表达主菌毛蛋白FimA与短菌毛蛋白Mfa1的P. gingivalis381可激活TLR2，使P. gingivalis被吞入富Rab5的膜泡中而进入初级内体，并上调LC3-Ⅱ、LAMP1水平，形成自噬特有的胞内双层膜性结构，引起细胞自噬和细菌死亡。P. gingivalis具有在不同环境中调节菌毛表达的能力[6]，有助于通过调节与DC-SIGN的结合而影响其在慢性炎症中的致病性。

4 总结

目前，P. gingivalis与细胞自噬间关系的研究多集中于血管内皮细胞，揭示了P. gingivalis诱导自噬与动脉粥样硬化、心肌梗死等心血管疾病的联系，P. gingivalis诱导牙龈上皮细胞以及其他宿主细胞发生自噬的研究也正方兴未艾。P. gingivalis可能通过自噬途径逃避宿主免疫，以获在胞内的持续存活并增殖，而其中的具体分子机制尚不明晰。因此通过调节自噬作为牙周病的新疗法正逐步成为研究的热点。细胞自噬在P. gingivalis致病过程中作用的研究不断深入，将为牙周病及相关系统性疾病的干预治疗提供新的思路。

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Research advances on the molecular mechanism of autophagy regulated by Porphyromonas gingivalis

Zhao Yan1, Yu Yang2, Kou Yurong1,2.
(1. Dept. of Periodontics, School of Stomatology, China Medical University, Shenyang 110002, China;2. Dept. of Oral Biology, School of Stomatology, China Medical University, Shenyang 110002, China)
Supported by: The National Natural Science Foundation of China (81300886). Correspondence: Kou Yurong, E-mail: kouyurong2005@aliyun.com.

Autophagy is an intracellular conservative degradation pathway. This event has been considered as a key step in host defense against bacterial infection. However, Porphyromonas gingivalis, as one of the evidence-sufficient periodontal pathogens, can utilize self-induced autophagy to achieve persistent intracellular survival and proliferation, which enable this organism to escape from host immune surveillance. This review focuses on molecular mechanism of P. gingivalis internalization and autophagy to illuminate its pathogenesis and to further explore the relationship between P. gingivalis and systemic diseases.

Porphyromonas gingivalis;  autophagy;  vascular endothelial cell;  gingival epithelial cell

R 781.4

A

10.7518/hxkq.2017.06.017

2017-02-14；

2017-05-12

国家自然科学基金（81300886）

赵妍，硕士，E-mail：zzyan0802@hotmail.com

寇育荣，副教授，博士，E-mail：kouyurong2005@aliyun.com

（本文编辑  李彩）