胞浆分裂阻滞微核试验评价接触职业危害的研究进展

郑艳艳

(广西壮族自治区职业病防治研究院，广西 南宁 530021)

胞浆分裂阻滞微核试验评价接触职业危害的研究进展

郑艳艳

(广西壮族自治区职业病防治研究院，广西 南宁 530021)

微核试验是国际上公认的检测遗传损伤重要技术手段之一，而胞浆分裂阻滞微核试验是近年发展起来的可观察到多种遗传学终点的试验，它能分析染色体断裂、DNA错误修复、基因扩增、坏死、凋亡和细胞分裂抑制等，其在接触职业危害评价中得到大量应用。

胞浆分裂阻滞微核试验，微核，职业危害；遗传毒性

自从在人体网状细胞中发现Howell-Jolly小体(即微核试验中的微核)后，经过多年的发展，微核试验(micronucleus test，MNT)已成为检测细胞遗传毒性的标准试验，MNT是公认检测染色体异常简便的方法，是必做的遗传毒理学安全性评价试验，其原理是由于受到外界因素(物理、化学、生物)损害后导致染色体丢失或断片形成出现微核。而胞浆分裂阻滞微核试验(cytokinesis-block micronucleus cytome assay，CBMN)是将细胞松弛素B(cytochalasin-B，Cyt-B)加入淋巴细胞培养液中，使淋巴细胞胞质分裂受到抑制，核分裂不受影响，从而计数双核淋巴细胞中的微核，该方法排除了细胞分裂的影响，也可观察到多种遗传学终点，其结果比常规微核检测方法更可信。近年，CBMN已发展成为可观察多种损害终点的试验，一张制好的片里可分析染色体断裂、DNA错误修复、基因扩增、坏死、凋亡和细胞分裂抑制等[1-3]。本文就CBMN试验近年来在方法学上的研究和在接触职业危害评价中的应用进展做如下综述：

1 CBMN试验方法

1.1 受试细胞的选择 l999年人类微核计划工作组认为原代细胞及各类细胞株可用于微核试验，但目前尚未查到有关资料认为哪类细胞最适合用于微核试验。通常情况下依据试验目的、遗传背景、细胞的增殖时间、微核发生率等选择细胞类型。在2002年国际遗传毒性测试程序工作组推荐使用人体淋巴细胞和V79、CHL/IU、CHO和L5l78Y啮齿类细胞株，一般情况作为职业暴露人群生物监测首选是人体外周血淋巴细胞[4]。

1.2 植物血凝素(phytohemagglutinin，PHA)和细胞松弛素B的应用 在人淋巴细胞1640培养液中都含有一定浓度的PHA，PHA是低聚糖与蛋白质的复合物，属高分子糖蛋白，能促使淋巴细胞转化为淋巴母细胞进行分裂增殖。处在G0期大部分淋巴细胞，在PHA刺激下进行有丝分裂，可通过双核淋巴细胞和核分裂指数这两项指标得到试验的最佳PHA浓度。CBMN试验中细胞松弛素B破坏微丝的网络结构并阻止胞质分裂，在第一个有丝分裂周期加入Cyt-B，第二个有丝分裂期收获细胞，就能获得一次分裂的双核细胞。在进行CBMN试验时，PHA刺激淋巴细胞后44 h是加入Cyt-B的最佳时间，而Cyt-B最为适宜浓度为2～4 μg/mL[5-6]。

1.3 细胞低渗处理 CBMN试验是否成功关键是看制片的效果，一张好的细胞片背景清晰，并有足够多细胞膜完整的双核淋巴细胞，这与制片中低渗处理及固定技术密切相关。低渗液浓度是关键环节，浓度过低容易导致低渗过度，细胞胞膜破裂不完整，浓度过高细胞不膨胀。邬洪梁[7]采用0.15 mol/L KCL低渗处理红细胞，淋巴细胞适度膨胀但不破裂。也有人提议进行多观察终点的生物监测是不进行低渗处理，这样可直接保留细胞分裂中期凋亡和坏死细胞的形态，低渗处理可能破坏凋亡细胞和坏死细胞。

1.4 读片分析 CBMN试验可计数微核、核质桥(nucleoplasmic bridges，NPBs)、核 芽 (nuclear buds，NBUDs)、坏死细胞、凋亡细胞和计算核分裂指数(nuclear division index，NDI)，NDI表示细胞增生水平，是细胞分裂抑制效应指标。之前CBMN检测仅观察双核细胞中的微核，而忽略可能在体内受到损害的凋亡或坏死细胞。Fenech等[8]提出一般要同时观察单核淋巴细胞的微核、双核淋巴细胞的微核、细胞凋亡、细胞坏死等4个终点才能获得全面准确的信息。单核淋巴细胞中的微核提示细胞在采血前已受到损伤，双核淋巴细胞的微核是原有的微核和体外培养在细胞分裂过程中染色体损伤所形成的微核，两者同时计数可获得较全面的信息。CBMN试验现已发展成为一种可分析染色体断裂或丢失、双着丝粒染色体、基因扩增、细胞凋亡、坏死及细胞分裂不平衡等多种损伤终点的综合试验方法，它提供了一个多终点观察遗传损伤的技术。

1.5 实验中的质量控制 陈洋等[9]探讨如何在外周血淋巴细胞培养微核试验中做好质量控制，通过采血、接种、培养、收获等步骤，严格按照操作规程进行实验操作，不断完善和总结经验，做好室内质控制、人员的培训、仪器设备及试剂进行规范化管理。一张片的细胞数量多，分散均匀，着色良好，核浆分明，透明度好，这些都可以极大的提高了微核的检出率和阅片效率。实验室内质量控制对提高微核检出率和阅片速度起很好的作用，能保证质量，及时准确地反映细胞损伤情况，为生物剂量估算、放射损伤诊断与治疗以及职业健康监护提供依据。

2 CBMN试验方法新的观测指标

2.1 核质桥(NPBs)NPBs是指CBMN试验双核细胞中两个细胞核之间相连的桥状核，宽度小于核直径的1/4，并且颜色与主核一致，有时在双核之间可观察到多个NPB。有研究提出核质桥形成机制[10]，是DNA链断裂后的错误修复和由于端粒缩短或缺少端粒结合蛋白所导致的端粒末端融合，在有丝分裂后期中心粒被拉向细胞两极而产生核质桥。正常细胞随着细胞分裂核质桥会断裂，因此在普通微核试验中无法观察到核质桥，但在CBMN试验中，因胞质分裂被阻滞所以较易观察到双核细胞中的核质桥。断裂的核质桥也有可能是微核形成的机制之一，NPBs的出现表明由于DNA链断裂错误修复而导致的遗传损伤。Thomas等[11]提出CBMN试验应该记录双核细胞中的核质桥，来判定染色体的重组情况。

2.2 核芽(NBUDs)NBUDs是指CBMN试验双核细胞中与细胞核连接的一个芽突状物质，颜色与主核一致，是基因扩增的生物标志物。核芽是在DNA双链断裂后，错误修复或细胞清除扩增的DNA形成的。Haaf等[12]研究发现细胞照射γ射线3 h后DNA修复相关基因Rad51重组蛋白复合体会聚集在某个特定位置，并通过核芽的方式形成微核而被清除，此研究表明核芽的产生与DNA损伤修复有极大关联。核芽也被认为是微核形成的机制之一，但还需要做进一步研究。

2.3 核分裂指数(NDI)CBMN试验中需要观察500个细胞来计算核分裂指数，在显微镜下观察并计数单核、双核、三核、四核细胞，计算参考公式：NDI=(单核数+2×双核数+3×三核数+4×四核数)/细胞总数。NDI是评价细胞增殖情况，核分裂指数越高，细胞增殖越良好。

2.4 细胞凋亡和坏死 凋亡细胞和坏死细胞已经纳入CBMN试验的检测新指标。早期凋亡细胞核内有浓缩染色质、完整胞质和核膜；而晚期凋亡细胞有完整胞质和胞质膜、但核碎片已成为核小体；凋亡细胞核染色比活细胞深。早期坏死细胞细胞胞质染色淡、胞质或核含多个空泡、胞质膜受损但核清晰完整；晚期坏死细胞胞质缺失、核膜受损或不完整、只有部分完整的核结构、可见核质外泄；坏死细胞的核染色一般比活细胞浅。凋亡和坏死细胞的比例可反映外界理化因素对细胞的毒性。

在毒性评价上NDI和坏死、凋亡细胞这些指标能为细胞生长抑制和细胞毒性提供重要信息。新发展的观察指标体现了CBMN试验中细胞组学方法的重要性，仅在一个实验中就能检测到遗传毒性、细胞毒性以及细胞生长抑制等现象。CBMN试验的发展扩大它的评价内容和应用范围，例如在营养毒理学、肿瘤研究、职业暴露人群生物监测等领域均得到较多的应用。

3 CBMN试验在接触职业危害评价中的应用

3.1 职业暴露人群的生物监测 CBMN试验广泛应用于职业暴露人群的监测，微核率是评价职业人群暴露于遗传毒物的早期生物效应敏感指标。Veronika等[13]发现，暴露于五氧化二钒工人的微核率与阴性对照组比增加2.5倍、核质桥是阴性对照组的7倍、核芽是阴性对照组的3倍，细胞坏死也显著增高。金力奋等[14]检测24名接触肿瘤药物的护士外周血淋巴细胞的遗传损伤时用CBMN试验和彗星试验，发现其微核细胞率和彗星尾长均明显高于同一医院非接触抗肿瘤药物的24名女医生。陆垚等[15]研究铅暴露工人外周学淋巴细胞遗传损伤，研究发现胞质分裂阻滞微核试验暴露组工人双核微核率和微核细胞数均高于阴性对照组，且双核微核率、微核细胞率、核桥率与工龄呈正相关。

3.2 放射性物质接触评价 有研究证明，淋巴细胞微核率及染色体畸变率与放射性物质累积剂量及放射工龄呈线性相关。目前，有关放射性物质微核试验的报道文献也比较多，微核分析可以作为辐射损伤的遗传学效应的初筛指标。Sari-Minodier等[16]用CBMN试验评价长期暴露于低剂量辐射的医务人员的染色体损伤情况，结果显示，暴露组染色体损伤所致的微核发生率明显高于阴性对照组。祝俊等[17]采集医用X射线工作人员微量全血，用胞浆分裂阻滞微核法检测其长期受小剂量辐射的遗传学效应，发现其微核率显著高于阴性对照组的14.6‰，并且微核率随放射工龄的增加而增高，呈现累积剂量-反应关系，反映受照者的遗传损伤程度。

3.3 有害重金属接触评价 对有害重金属接触作业人群的遗传毒性效应监测，CBMN试验快速而准确。易娟等[18]对29名镉作业者、35名健康人的静脉血进行微核试验，比较淋巴细胞胞浆分裂阻断微核法与普通微核法的试验结果，发现CBMN法的微核率明显高于普通微核法(P＜0.01)，说明了CBMN试验在接触有害重金属作业人群中的实用性。张杰等[19]采用CBMN试验观察不同剂量氟、砷单独及联合作用对正常人淋巴细胞染色体的损伤情况，研究表明不同剂量亚砷酸钠与氟化钠均可引起淋巴细胞染色体损伤；两者联合染毒只是简单相加作用。

3.4 有机物接触评价 Noel等[20]采用人外周血淋巴细胞CBMN试验对5,7,4'-三羟黄酮进行测定，结果显示，5,7,4'-三羟黄酮可能存在潜在的遗传毒性，微核率随剂量的增高而增高，证明了高剂量的黄酮类化合物为断裂剂。在研究l,2,4-苯对人淋巴细胞的遗传毒性时，Chung等[21]用CBMN试验结合荧光原位杂交技术，发现苯致淋巴细胞微核率升高，呈剂量反应关系。廖静等[22]应用胞浆分裂阻滞微核法检测三卤甲烷和卤乙腈的遗传毒性，及其消毒副产物对人来源的肝肿瘤细胞HepG2微核率和核分裂指数(NDI)的影响，结果三卤甲烷和卤乙腈对HepG2细胞染色体具有断裂作用。赵五红等[23]采用人外周血淋巴细胞胞质分裂阻滞微核试验探讨了大气中常见的5种多环芳烃的致突变性，分别检测不同浓度5种多环芳烃对人淋巴细胞的微核诱导作用，结果表明不同浓度5种多环芳烃微核率与阴性对照组比较有显著性差异，并且存在明显的剂量-反应关系，说明多环芳烃具有一定的潜在危害。

4 展望

微核试验已从早期的普通微核试验发展为精确的胞质分裂阻滞微核试验，现作为检测遗传损伤的重要手段，能更全面准确反映多种细胞损伤，是一种多观察终点的生物检测方法。CBMN试验计算微核率时仅计数双核淋巴细胞的微核，比传统的微核试验更精确、便于识别。CBMN试验克服了常规微核法不够精确的缺点，且比经典的染色体畸变分析简便。随着社会的逐渐重视，CBMN试验为化学致癌因素的危险度评价以及预测肿瘤的发展和预后提供细胞组学生物学标志，可以广泛应用于职业暴露人群的健康监护领域，其具有推广价值。

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R394

A

1003—6350（2017）19—3195—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.19.033

广西卫生厅自筹经费科研课题（编号：Z2014239）

郑艳艳。E-mail：zhengyy-001@163.com

2016-10-26)