HPLC法测定健腰通颗粒中黄芪甲苷的含量
2017-02-27孙永慧赵静孙楠
孙永慧+赵静+孙楠
[摘要]目的 建立健腰通颗粒中黄芪甲苷的含量测定方法。方法 以高效液相色谱法测定健腰通颗粒中黄芪甲苷的含量,采用Diamonsil C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5μm);流动相为乙腈-水(30∶70);流速:1.0 ml/min;柱温:40℃;蒸发光散射检测器参数中氮气流量:2.5 L/min;漂移管温度:105℃。结果 黄芪甲苷进样量在0.56~4.20 μg(r=0.9994)范围内线性关系良好。加样回收率为95.83%(RSD为1.39%,n=5)。结论 本含量测定法重复性和精密度良好,结果可靠准确,可作为该制剂质量的检测方法。
[关键词]健腰通颗粒;黄芪甲苷;高效液相色谱法;含量测定
[中图分类号] R927.2 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721(2016)11(c)-0140-03
[Abstract]Objective To establish the method for the determination of astragaloside Ⅳ in Jianyaotong Granules.Methods HPLC was used the quality of astragaloside Ⅳ in Jianyaotong Granules,analytical column was Diamonsil C18 (4.6 mm×250 mm,5 μm).Mobile phase was Acetonitrile-Water(30∶70).Flow rate was 1.0 ml/min,the parameter of ELSD detector:the flow rate of N2 was 2.5 L/min;the temperature of drift tube was 105℃.Results The linear range of astragaloside Ⅳ was from 0.56 to 4.20 μg(r=0.9994).The average recovery was 95.83%(RSD=1.39%,n=5).Conclusion This method is proved to be sensitive and reliable.It can be the quality detection method of Jianyaotong Granules.
[Key words]Jianyaotong Granules;Astragaloside Ⅳ;HPLC;Content determination
健腰通颗粒是由黄芪、鸡血藤、骨碎补、桑寄生、牛蒡子、补骨脂、三七、淫羊霍、水蛭、鹿茸等多种中药组成的复方制剂。具有疏筋养血,补肾益气,强腰健肾的功效。用于腰间盘突出,腰椎增生及颈腰综合症,具有良好的治疗效果。黄芪是该制剂中起主要作用的药物,本实验以高效液相色谱(HPLC)法对健腰通颗粒中黄芪甲苷进行了含量测定[1-14],以控制该制剂的质量。
1仪器与试药
Waters 2695-2998型高效液相色谱仪(Waters公司,Empower工作站);蒸发光散射检测器(Alltech 2000型,奥泰克公司);BP221S型电子天平(德国赛多利斯公司);健腰通颗粒(批号:20150301,20150302,2015 0303),由黑河市中医院制剂室生产;黄芪甲苷对照品(批号:110781-201209), 从中国药品生物制品檢定所购得。甲醇(色谱纯,迪马公司);D101型大孔吸附树脂(天津市光复精细化工研究所,批号:20140510);三氯甲烷(天津化学试剂厂,批号:20150915);正丁醇(天津化学试剂厂,批号:20151020);氨水(天津化学试剂厂,批号:20151201);无水乙醇(天津化学试剂厂,批号:20151208);甲醇(天津化学试剂厂,批号:20150815)。
2方法与结果
2.1色谱条件
色谱柱型号:Diamonsil C18(4.6 mm×250 mm,5 μm);流动相:乙腈-水(30∶70);流速为1.0 ml/min;蒸发光散射检测器参数中氮气流量:2.5 L/min;漂移管温度:105℃;柱温是40℃。此分离检测条件下,供试品中黄芪甲苷色谱峰与其它色谱峰分离度良好,基线平稳,阴性制剂无干扰,HPLC色谱图见图1。
2.2供试品溶液的制备
取健腰通颗粒(批号:20150301)3袋,粉碎,取粉末25 g,精密称定,置索氏提取器中,加三氯甲烷适量,加热回流2 h。弃去三氯甲烷提取液,滤纸筒挥干三氯甲烷,再加甲醇适量,加热回流4 h。甲醇提取液回收溶剂并浓缩至干,残渣加水20 ml,稍微水浴加热搅拌使溶解,室温放冷,用水饱和的正丁醇振摇提取4次,40 ml/次。正丁醇提取液合并,用氨试液振摇洗涤2次,40 ml/次,弃去氨试液,正丁醇提取液蒸干,残渣加水10 ml使溶解。水液通过D101型大孔吸附树脂柱(内径1.5 cm,装入树脂高12 cm),用水50 ml洗脱,弃去水洗脱液,再用40%乙醇30 ml洗脱,弃去洗脱液,继续用70%乙醇80 ml洗脱,收集洗脱液,蒸干,残渣加甲醇适量使溶解并转移至5 ml量瓶中,加入甲醇定容至刻度,摇匀,用微孔滤膜(0.45 μm)滤过,得健腰通颗粒待测供试品溶液。
2.3黄芪甲苷对照品溶液的制备
取黄芪甲苷对照品约3 mg,精密称定,置于10 ml容量瓶中,加色谱甲醇至刻度,振摇使溶解混匀,得每1 ml含0.28 mg的黄芪甲苷对照品溶液。
2.4线性关系的考察
取黄芪甲苷对照品溶液分别进样2、5、8、10、12、15 μl,按“2.1”项下色谱条件进样测定,以进样量微克数的自然对数为横坐标,以黄芪甲苷色谱峰面积的自然对数为纵坐标,进行线性回归,得到回归方程为:Y=1.6418 X+10.9741(r=0.9996),提示黄芪甲苷对照品的进样量在0.56~4.20 μg有良好的线性关系,可以用外标两点法进行含量测定。
2.5精密度试验
取黄芪甲苷对照品溶液,吸取5 μl,连续进样6次,测得黄芪甲苷对照品色谱峰面积的RSD值为1.97%,结果表明精密度良好。
2.6稳定性试验
取健腰通颗粒供试品溶液,在7个不同时间点进样测定,分别是:0、2、4、6、8、10、12 h,每次精密进样20 μl,结果健腰通颗粒的供试品溶液在12 h之内测定,黄芪甲苷峰面积数值是稳定的,RSD=2.56%。
2.7重复性试验
取同一批健腰通颗粒,粉碎后称取6份,每份约25 g,精密称定,按照“2.2”项下方法提取制备供试品溶液。分别精密吸取黄芪甲苷对照品溶液5 μl、10 μl以及供试品溶液20 μl,按照前述色谱条件进样,测定,以外标两点法对数方程计算供试品中黄芪甲苷的含量。结果测得黄芪甲苷含量分别为0.0328、0.0336、0.0351、0.0343、0.0358、0.0353 mg/g,平均值为0.0345 mg/g(RSD=3.24%),结果显示本药含量测定方法有较好的重复性。
2.8加样回收率试验
取同一批健腰通颗粒供试品,粉碎,分别取细粉6份,每份约12.5 g,精密称定重量,在每份供试品细粉中分别加入黄芪甲苷对照品0.42 mg(精密吸取浓度为0.28 mg/ml的黄芪甲苷对照品溶液1.5 ml),按照前述“2.2”供试品溶液制备项下的方法进行提取以及进行含量测定见表1。
五份健腰通颗粒供试品的平均加样回收率为94.79%(RSD=1.46%)。结果显示该药回收率较高,测定方法可靠。
2.9供试品测定
取三批健腰通颗粒(批号:20140901,20140902, 20140903)各3份,粉碎,每份取约25 g,精密称定重量,按照前面2.2项下供试品溶液制备方法操作,得到待测黄芪甲苷含量的健腰通颗粒供试品溶液。分别精密吸取黄芪甲苷对照品溶液5、10 μl以及供试品溶液20 μl,按照前述方法进样、测定、计算供试品中黄芪甲苷的含量,见表2。
结果显示,三批健腰通颗粒中黄芪甲苷含量平均为0.0373 mg/g,按平均值80%制订健腰通颗粒中黄芪甲苷含量[15],每克健腰通颗粒中黄芪甲苷含量应≥0.03 mg。
3讨论
本方中黄芪起主要作用,其主要成分为黄芪甲苷和毛蕊异黄酮葡萄糖苷等,本试验通过测定该药中黄芪甲苷的含量来控制该制剂的质量。含量测定参考《中国药典》2015年版一部“黄芪”药材[含量测定]项下的方法[1],并参考文献[2-14],采用高效液相色谱-蒸发光散射法进行测定,根据实际色谱分离效果调整流动相乙腈-水的比例,在乙腈-水(30∶70)时黄芪甲苷色谱峰分离度良好,保留时间适宜,且阴性对照无干扰,是该制剂黄芪甲苷含量测定最优的色谱条件。
蒸发光散射检测器用于测定黄芪甲苷的含量,重复性、灵敏度、稳定性均能符合含量测定的要求。本试验对漂移管温度、雾化器温度、流动相流速以及载气流速等试验参数进行了研究试验、优化调整。本试验的最终优化条件:流动相为乙腈-水(30∶70),流速为1.0 ml/min,柱温为40℃,蒸发光蒸发温度为105℃,载气(氮气)流速为2.5 L/min。
综上所述,本黄芪甲苷含量测定方法快速、灵敏、简便,精密度、线性、重复性、稳定性以及加样回收率均符合要求,结果准确可靠,重复性好,可用于健腰通颗粒的质量控制。
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(收稿日期:2016-08-29 本文编辑:顾雪菲)