EZH2抑制剂GSK126对Neuro-2a细胞增殖分化的影响及其可能机制

林伟仁，朱 锋，应荣彪，陈亚天，曾玲晖

(1. 浙江省台州市肿瘤医院内科，浙江 温岭 317502；2. 浙江大学城市学院医学院药学研究所，浙江 杭州 310015)

◇研究简报◇

EZH2抑制剂GSK126对Neuro-2a细胞增殖分化的影响及其可能机制

林伟仁1，朱 锋2，应荣彪1，陈亚天2，曾玲晖2

(1. 浙江省台州市肿瘤医院内科，浙江 温岭 317502；2. 浙江大学城市学院医学院药学研究所，浙江 杭州 310015)

EZH2抑制剂；GSK126；Neuro-2a细胞；mTOR信号通路；凋亡；分化

神经母细胞瘤(neuroblastoma，NB)是常见的儿童恶性肿瘤，在手术、放化疗及介入等多种手段综合治疗下，总体疗效仍然极差。近年来研究发现，果蝇zeste基因增强子同源物2( enhancer of zeste homolog 2，EZH2)能抑制相关抑癌基因，明显增加神经母细胞瘤发生、发展的风险[1]。GSK126是一种新型的选择性EZH2抑制剂[2-3]，其在实体瘤方面的药效探究目前相对较少。本文将对GSK126在神经母细胞瘤Neuro-2a细胞中的作用及其可能机制作初步探讨。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器 GSK126(上海瀚香生物科技有限公司)；兔多克隆抗体phosph-mTOR(Ser2448)、phosph-S6(Ser240/244)、mTOR和S6(美国Cell Signaling Technology公司)；流式细胞仪FACSCalibur(美国BD公司)。

1.2 方法 GSK126先溶解于DMSO，保存于-20 ℃，实验时用培养基稀释到所需终浓度，低、中、高剂量组分别设定为5、20、50 μmol·L-1。采用SRB法检测细胞增殖，流式细胞仪检测细胞周期和凋亡，以无血清培养细胞观察GSK126对细胞分化的影响，蛋白印迹法检测mTOR信号通路相关蛋白的表达。

Tab 1 Cell cycle distribution and apoptotic rate of Neuro-2a cells treated with GSK126

*P<0.05vscontrol group

2 结果

2.1 GSK126对Neuro-2a细胞存活率的影响 GSK126在5～25 μmol·L-1间未显示明显的抑制作用，抑制率在10%以下，当浓度增加到50 μmol·L-1时则显示较强抑制作用，抑制率达到70%以上。

2.2 GSK126对Neuro-2a细胞周期及细胞凋亡的影响 不同浓度GSK126(5、20、50 μmol·L-1)处理细胞后，流式细胞仪检测结果显示，5、20 μmol·L-1的GSK126给药组细胞周期及凋亡比例未发生明显改变。但50 μmol·L-1GSK126诱发明显的细胞凋亡，且细胞处于G0/G1期及G2/M期的比例明显下降，细胞生长主要阻滞在S期，差异有统计学意义(P<0.05)，见Tab 1。

2.3 GSK126明显促进Neuro-2a细胞的分化 10%血清培养对照组细胞一直处于增殖状态。无血清培养基对照组培养12 h后，细胞虽有明显延伸的突起，但突起较细较短，且分化细胞数(突起长度为胞体直径2倍以上的细胞)仅占(10.2±1.1)%。而GSK126处理的细胞在无血清培养基培养12 h后，细胞突起生长明显，同时胞体直径明显变大，低、中、高GSK126剂量组分化细胞分别占(15.2±1.5)% (P<0.05)、(20.3±2.1)%(P<0.05)和(30.4±3.1)%(P<0.01)。

2.4 GSK126能有效抑制Neuro-2a细胞mTOR信号通路活性 在不同浓度GSK126(5、20、50 μmol·L-1)作用下，磷酸化mTOR蛋白与总蛋白的比值分别下降到对照组的81%(P<0.05)、73%(P<0.05)和61%(P<0.01)，磷酸化S6蛋白与总蛋白的比值分别下降到对照组的82%(P<0.05)、67%(P<0.05)和56%(P<0.01)，随药物浓度呈剂量依赖性下降。

3 讨论

本研究发现GSK126在低浓度下抑制Neuro-2a细胞增殖和促进凋亡的作用并不明显，但能有效促进细胞分化，并且随着GSK126药物浓度的增加，分化细胞的比例亦相应增加。研究表明，EZH2对神经细胞特性的维持和细胞分化过程具有调控作用，与多种神经系统肿瘤的发生、分级及治疗密切相关[1,4]。由此提示GSK126作为EZH2的抑制剂，可能通过影响神经母细胞瘤分化状态，进而改变神经肿瘤的预后。

在众多参与神经母细胞瘤细胞增殖分化的细胞信号传导通路中，mTOR处于枢轴位置。已在神经母细胞瘤患者中证实，mTOR 信号病理性激活是病情预后不良的标志[5]，下调EZH2的表达可抑制mTOR信号的异常激活[6]。本研究表明，随着EZH2蛋白特异性抑制剂GSK126药物浓度的增加，mTOR及S6等mTOR信号相关蛋白磷酸化降低，mTOR通路活性下降，且Neuro-2a细胞变大、突起变粗变长、分化细胞的比例相应增加。由此可见，GSK126适度下调mTOR活性有利于其调控Neuro-2a细胞分化。本研究中，高剂量GSK126作用下亦可抑制细胞增殖和促进凋亡，这对于Neuro-2a细胞进行分化和维持分化状态可能也起到了必不可少的作用。在后续的研究中，我们将以此为基础，对GSK126的作用机制，特别是通过调节mTOR信号通路调节神经母细胞瘤分化的具体机制做进一步的探究，以期找到可能的关键靶点，从而为神经母细胞瘤的治疗提供新的方法和策略。

[2] Mccabe M T，Ott H M，Ganji G，et al. EZH2 inhibition as a therapeutic strategy for lymphoma with EZH2-activating mutations[J].Nature，2012，492(7427)：108-12.

[3] Chen Y T，Zhu F，Lin W R，et al. The novel EZH2 inhibitor, GSK126, suppresses cell migration and angiogenesis via down regulating VEGF-A[J].CancerChemotherPharmacol，2016， 77(4)：757-65.

[4] 陈小霞，谢 娟，黄 成， 等. EZH2对HSC-T6细胞增殖活化的影响及其部分机制研究[J]. 中国药理学通报，2015，31(8)：1061-5.

[4] Chen X X，Xie J，Huang C，et al. EZH2 plays a role in HSC-T6 cell proliferation and activation affecting MAPK/ERK and PI3K/AKT pathway[J].ChinPharmacolBull， 2015，31(8)：1061-5.

[5] Opel D，Poremba C，Simon T，et al. Activation of Akt predicts poor outcome in neuroblastoma[J].CancerRes，2007，67(2)：735-45.

[6] Zhang W，Lv S H， Liu J，et al. PCI-24781 down-regulates EZH2 expression and then promotes glioma apoptosis by suppressing the PIK3K/Akt/mTOR pathway[J].GenetMolBiol，2014，37(4)：716-24.

Effect of GSK126, a novel EZH2 inhibitor, on proliferation and differentiation of Neuro-2a cells

LIN Wei-ren1, ZHU Feng2， YING Rong-biao1, CHEN Ya-tian2, ZENG Ling-hui2

(1.DeptofInternalMedicine,TaizhouCancerHospital,WenlingZhejiang317502,China; 2.DeptofPharmacy,SchoolofMedicine,ZhejiangUniversityCityCollege,Hangzhou310015,China)

EZH2 inhibitor；GSK126；Neuro-2a cells；mTOR signaling pathway；apoptosis；differentiation

时间：2017-1-13 11:38:00

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170113.1138.054.html

2016-11-16，

2016-12-12

浙江省医药卫生科研资助项目(No 2015KYA148);杭州市科技局重大科技创新资助项目(No 20152013A02)

林伟仁(1971- )，男，副主任医师，研究方向：肿瘤的诊治，E-mail: linweiren1971@163.com； 朱 锋(1978- )，女，硕士，讲师，研究方向：药理学，共同第一作者，E-mail: zhuf@zucc.edu.cn； 曾玲晖(1972- )，女，博士，教授，研究方向：药理学，通讯作者，E-mail: zenglh@zucc.edu.cn

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.02.027

A

1001-1978(2017)02-0289-02

R329.24；R329.25；R730.264；R739.4；R916.4