烟酸通过下调PCSK9的表达促进HepG2细胞摄取LDL-C

欧 露，麻燕妮，张彩平，刘 英，张 敏，丁新新，段理人，龙石银，田 英

(1. 常德市妇幼保健院遗传科，湖南 常德 415000；2.南华大学生物技术系，湖南 衡阳 421001；3.常德市职业技术学院医学系，湖南 常德 415000)

烟酸通过下调PCSK9的表达促进HepG2细胞摄取LDL-C

欧 露1,2，麻燕妮2，张彩平2，刘 英3，张 敏2，丁新新2，段理人2，龙石银2，田 英2

(1. 常德市妇幼保健院遗传科，湖南 常德 415000；2.南华大学生物技术系，湖南 衡阳 421001；3.常德市职业技术学院医学系，湖南 常德 415000)

目的 探讨烟酸对HepG2细胞摄取及代谢LDL-C的影响，寻找烟酸改善血脂异常，减缓动脉粥样硬化进程的相

烟酸；低密度脂蛋白受体；固醇调节元件结合蛋白2；前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶9型；人源性缺脂蛋白血清；25羟胆固醇

烟酸(niacin)又称维生素B3或尼克酸，具有重要的生理作用，然而，让它备受关注的是其调脂作用[1]。早在20世纪60年代，烟酸就作为调脂药物开始应用于临床[2]。研究表明[2-3]，烟酸通过影响Apo AI、CETP、ABCA1的表达，进而调节HDL-C水平。在药理剂量下，烟酸是最有效的升高血浆HDL含量的调脂药物，同时能降低血浆低密度脂蛋白(low density lipoprotein cholesterol, LDL)、脂蛋白a(lipoprotein a, Lip a)以及甘油三酯(triglycerides, TG)等的含量，具有预防和治疗心血管疾病的作用[4-5]。作为既能升高HDL，又能降低LDL的调脂药物，烟酸升高HDL的作用已被广泛认可，但是其降低LDL的作用及机制却有待完善。

血浆高LDL-C水平是心血管疾病(cardiovascular disease, CVD)的危险因素之一[6]。超过70%的血浆LDL-C通过LDLR途径经肝细胞代谢[7]。而LDLR的表达同时受到固醇调节元件结合蛋白2(sterol regulatory element binding proteins 2, SREBP2)等因子的转录水平调节[8]，又受到前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶9型(proprotein convertase subtilisin/kexin type 9, PCSK9)等因子的转录后调节[9]。SREBP2是存在于内质网上的固醇敏感器，当细胞内胆固醇水平处于失平衡状态时，它能相应调节下游靶基因LDLR及PCSK9等因子的表达[10-11]。PCSK9蛋白成熟体则能与LDLR的EGF-A区域结合，并诱导LDLR进入溶酶体降解[12]。为证实烟酸是否通过调节SREBP2和PCSK9的表达而降低LDL-C水平，本研究运用烟酸作用HepG2细胞，检测调控LDLR的相关因子的表达变化，试图寻找烟酸的新的降血浆LDL-C的机制。

1 材料与方法

1.1 细胞与试剂 人肝癌细胞系HepG2购自中国科学院细胞生物学研究所上海细胞库。烟酸购自Biosharp公司；人源性LDL购自广州弈源公司；人源性缺脂蛋白血清(human lipoprotein-deficient serum, LPDS)购自美国Biomedical Technologies Inc.公司；油红O和DMSO购自Amresco公司；苏木精购自博士德生物公司；组织总胆固醇/游离胆固醇酶法测定试剂盒(E1015/E1016)购自北京普利莱基因技术公司；25-羟胆固醇(25-HC)购自美国Sigma公司；总RNA提取试剂盒(TRIzon Reagent)购自康为世纪生物科技有限公司；Donkey anti-rabbit IgG(Alexa Fluor 647)、兔抗人LDLR和PCSK9抗体购自美国Abcam公司；兔抗人β-actin购自美国CST公司；山羊抗人的SREBP2抗体购自美国R&D公司；辣根过氧化物酶标记的二抗：山羊抗兔和兔抗山羊均购自上海优维宁生物科技公司。其余试剂均为国产分析纯。

1.2 药物配制 烟酸工作液：DMSO配制成400 mmol·L-1的母液，胎牛血清稀释，0.22 μm滤器过滤分装，-20℃避光保存。

1.3 实验分组 油红O染色以及胆固醇含量测定实验分组为：① Basal;② Control;③ Niacin 300 μmol·L-1;④ Vehicle 0.075% DMSO)；其中②～④组加入25 mg·L-1LDL。

在溶媒对实验无影响的情况下，调整分组为：① Basal;② Control;③ LPDS(10%);④ 25-HC(10 mg·L-1);⑤ Niacin 300 μmol·L-1；其中②～⑤组加入25 mg·L-1LDL。

1.4 油红O实验 细胞培养至对数生长期，1×105个细胞/孔接种至预先放置好无菌盖玻片的6孔板内，培养24 h，药物孵育24 h。多聚甲醛固定30 min，油红O染色约7 min，苏木精染色约4 s，甘油封片，观察并拍照。

1.5 酶法测定胆固醇含量 细胞培养至对数生长期，1×105个细胞/孔接种至6孔板培养24 h，药物孵育24 h。收集细胞裂解液，离心，取上清。按照总胆固醇含量酶法测定试剂盒(E1015/E1016)的说明书操作，37℃水浴20 min后，酶标仪测定A570胆固醇含量。BCA试剂盒测定的细胞内总蛋白含量用以标化各样本的胆固醇值，标化后的胆固醇浓度单位为总胆固醇(游离胆固醇)/蛋白=μmol·g-1。

1.6 细胞表面LDLR含量流式检测 对数期生长的HepG2 以1×105个细胞/孔接种至6孔板内培养24 h，药物孵育24 h。收集细胞，PBS洗涤，0.50% BSA封闭，抗体孵育及洗涤。FL3 emission filter 流式细胞仪检测，Cell Quest Pro software(BD Biosciences)分析对比各组与Control的平均荧光强度。

1.7 mRNA含量检测 对数期生长HepG2细胞以1×106个细胞/孔接种至50 mL培养瓶，培养24 h，药物孵育24 h。根据TRIzon Reagent说明书提取总RNA。紫外分光光度仪测定OD260/OD280比值介于1.9～2.1；琼脂糖凝胶电泳分析RNA完整性，28S rRNA、18S rRNA条带清晰可见，提取的总RNA可用于后续实验。

根据逆转录试剂盒说明书操作，取2 μg总RNA逆转录合成cDNA，PCR扩增条件为：42℃、30 min，85℃、10 min；再取2 μg逆转录产物进行qPCR，反应体系为20 μL。引物由上海诺伦生物医药技术有限公司设计与合成(Tab 1)。qPCR扩增条件为：95℃预变性3 min；95℃变性12 s，62℃延伸40 s，40个循环。用ΔΔCT来计算基因的表达水平，计算公式如下：ΔCT=目的基因CT值-β-actin基因CT值；ΔΔCT=实验组ΔCT-对照组ΔCT；实验组/对照组基因表达水平的倍数=2-ΔΔCT。

1.8 蛋白含量检测 对数期生长HepG2细胞以1×106个细胞/孔接种至50 mL培养瓶，培养24 h，药物孵育24 h。收集细胞裂解液，离心，取上清，取5 μL蛋白液进行BCA蛋白定量。剩余蛋白液加入SDS-loading buffer，100℃条件下煮沸10 min，于-20℃保存，用于Western blot实验。Tanon ECL高敏成像系统对结果进行检测。各组细胞目的蛋白与内参β-actin的光密度比值，分别代表各目的蛋白表达水平。

Tab 1 The primer sequence

2 结果

2.1 油红O染色观察烟酸对HepG2细胞内脂质蓄积的影响 油红O染色观察，HepG2细胞中脂滴颗粒被染成橘红色，核呈蓝色。结果显示：与Basal组相比，Control组细胞内脂滴增多，提示本实验荷脂成功；与Control相比，Vehicle组细胞内红染脂滴无明显变化，提示溶媒对实验无影响。Niacin组油红O阳性细胞数及细胞内红染脂滴明显增加，见Fig 1。

Fig 1 Oil red O staining of HepG2 cells treated with niacin co-incubated with LDL(×40)

A:Niacin;B:Basal;C:Control;D:Vehicle

2.2 酶法测定HepG2细胞内胆固醇含量变化 为了进一步定量分析细胞内胆固醇含量，酶法测定结果显示：与Basal组相比，Control细胞内TC、FC水平增高，提示本研究细胞荷脂造模成功；与Control相比，Vehicle组细胞内TC水平有增高的趋势，FC水平有所下降，但差异无统计学意义(P>0.05)，提示溶媒对细胞摄取胆固醇无影响；Niacin组细胞内TC、FC水平明显增高(P<0.01)。提示烟酸促使HepG2细胞摄取胆固醇，见Fig 2。

Fig 2 Effect of niacin on total cholesterol and free cholesterol in HepG2 cells

**P<0.01vscontrol

2.3 烟酸对HepG2细胞LDLR表达的影响 本研究推测细胞内胆固醇含量增加可能是烟酸通过上调LDLR的表达，进而促进HepG2细胞对LDL-C的摄取。接下来运用流式细胞术、qPCR及Western blot检测LDLR的表达。结果显示，与对照组相比，烟酸处理的HepG2细胞中，LDLR mRNA含量升高，但差异无统计学意义(P>0.05)；细胞膜表面LDLR分布丰度及细胞内LDLR蛋白含量却明显增加(P<0.05)，见Fig 3。

2.4 烟酸对SREBP2表达的影响 LDLR的表达主要在转录水平受到SREBP2的调节，为了探究烟酸是否影响SREBP2，进而调控LDLR的表达，本研究检测了烟酸对SREBP2表达的影响。结果显示，烟酸处理组细胞内SREBP2的mRNA和蛋白表达都无明显改变。提示烟酸升高LDLR含量并不是通过SREBP2的转录水平调节，见Fig 4。

2.5 烟酸对PCSK9表达的影响 PCSK9是LDLR转录后水平的主要调控者。在生理条件下，PCSK9前体(PCSK9 precursor, pPCSK9)经过加工剪切形成成熟体(mature PCSK9, mPCSK9)，而mPCSK9则可以在翻译后水平调节LDLR的表达。为了探究在烟酸的作用下，LDLR是否受到PCSK9的转录后调节，

Fig 3 Effect of niacin on expression of LDLR in HepG2 cells

A:Cell surface LDLR was determined by FACS analysis. The relative expression of LDLR mRNA(B) and protein(C).*P<0.05vscontrol

Fig 4 Effect of niacin on expression of SREBP2 in HepG2 cells

The relative expression of SREBP2 mRNA(A) and protein(B). SREBP2 precursor(p) and mature form(m).*P<0.05,**P<0.01vscontrol

本研究检测了烟酸对PCSK9表达的影响，并检测了mPCSK9的相对含量。结果显示，烟酸明显减少了PCSK9的mRNA和成熟体蛋白含量(P<0.05)。提示烟酸可能通过下调PCSK9的表达，减少PCSK9成熟体蛋白含量，使得LDLR降解减少，进而增加LDLR含量，促进HepG2细胞摄取LDL-C。见Fig 5。

Fig 5 Effect of niacin on expression of PCSK9 in HepG2 cells

The relative expression of PCSK9 mRNA(A) and protein(B). PCSK9 precursor(p) and mature form(m).*P<0.05vscontrol

3 讨论

在世界各地，心血管疾病的发病率逐渐升高，严重威胁着人类的健康。据世界卫生组织预测，到2020年，心血管疾病死亡率将占据我国非传染性死亡率的首位[13]。LDL-C升高是心血管疾病发生的独立危险因素[14]，因此，有效地降低血浆LDL-C对预防和治疗心血管疾病至关重要。

烟酸作为目前临床上常用的一种降脂药物[15-16]，在药理剂量下，单独使用烟酸可以增加血浆HDL-C水平，并且明显降低血浆中LDL-C、VLDL及LDL水平[17-18]；烟酸联合其他降脂药物(如他汀类、贝特类、胆酸螯合剂类药物)，可以使HDL-C水平升高，LDL及TG水平明显下降[19]。烟酸升高血浆HDL的作用已被认可，但降低LDL-C的作用却有待完善。

为找寻烟酸降低血浆LDL-C的分子靶点，本实验以HepG2细胞为研究对象，LDL孵育细胞，模拟高脂环境，烟酸药物处理。油红O染色观察细胞内脂滴蓄积，并用酶法定量检测胆固醇含量，充分考虑溶媒对细胞的影响。在溶媒对实验无影响的前提下，合理地设计了LPDS的阳性对照[20]及25-羟胆固醇(25-HC)的阴性对照[21]。

本研究发现，在模拟的高脂环境下，烟酸能上调HepG2细胞LDLR蛋白的表达，进而促进细胞摄取及代谢LDL。检测LDLR表达的主要调节因子发现，SREBP2的表达并没有受到影响，这也意味着，烟酸并没有在转录水平上影响LDLR的表达。qPCR结果亦证实烟酸处理组LDLR的mRNA表达水平无明显升高。检测LDLR转录后调节因子的表达发现，烟酸处理组细胞中的PCSK9成熟体蛋白含量明显减少。提示烟酸可能通过下调PCSK9的表达，阻碍PCSK9蛋白成熟过程，进而减少PCSK9的成熟体蛋白含量，使得LDLR降解减少。这一点与前面的结果相一致：烟酸影响LDLR的蛋白水平，却对其mRNA含量无影响。本研究只是做了初步探讨，要进一步确定PCSK9是烟酸降低LDL-C的分子靶点，还有大量的研究工作要做。

(致谢：感谢给予本文实验提供研究场所的生物技术系的分子生物学实验室、蛋白化学实验室、细胞培养室、技能实验室及生物信息室的所有老师及同学，感谢本校省部级重点心血管病研究所、肿瘤研究所、病原微生物研究所对本实验无偿提供流式细胞仪、激光共聚焦显微镜等服务。)

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Niacin accelerates LDL-C uptake in HepG2 cells via downregulation of PCSK9

OU Lu1,2, MA Yan-ni2, ZHANG Cai-ping2, LIU Ying3,ZHANG Min2, YU Xin-xin2,DUAN Li-ren2, LONG Shi-yin2, TIAN Ying2

(1.DeptofGenetics,ChangdeMaternalandChildHealth-CareHospital,ChangdeHunan415000,China; 2.DeptofBiotechnology,UniversityofSouthChina,HengyangHunan421001,China; 3.DeptofMedicine,ChangdeVocationalTechnicalCollege,ChangdeHunan415000,China)

Aim To explore the effects of niacin on LDL-C uptake and metabolism in HepG2 cells, and to clarify the functions of niacin in lipid-lowering and slowing the atherosclerosis process,thus to provide a scientific basis for niacin as a lipid-lowering drug in clinical development.Methods Oil red O staining was used to observe HepG2 cells after lipid uptake. Enzymatic method was used to determine the content of intracellular free cholesterol(FC) and total cholesterol(TC). The LDLR levels on the surface of cell membrane were detected by immunofluorescence flow cytometer. The mRNA and protein expressions of LDLR, SREBP2 and PCSK9 were analyzed by qPCR and Western blot.Results The results of oil red O staining showed that the rate of oil red O-positive cells and the number of red lipid droplets were significantly increased in niacin group than control group. Niacin significantly increased the levels of TC and FC in HepG2 cells(P<0.05). What’s more, niacin significantly upregulated the expression of LDLR and significantly downregulated the protein expression of PCSK9, while it had no effect on the expression of SREBP2.Conclusion Niacin accelerates LDL-C uptake probably via downregulating the expression of PCSK9 and reducing the degradation of LDLR protein in HepG2 cells.

niacin; LDLR; SREBP2; PCSK9; LPDS; 25-HC

时间：2017-1-13 11:38:00

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170113.1138.038.html

2016-12-18，

2017-01-23

湖南省科技厅项目(No 2015SK2038)；湖南省卫生计生委项目(No B2015-49)；湖南省高层次卫生人才“225”工程项目基金；辽宁中医药大学重点实验室开放基金(2015)；湖南省教育厅项目(No 15C1217)；湖南省自然科学基金资助项目(No 2014JJ3104)；湖南省大学生研究性学习和创新性实验计划项目(No 2015-230)；衡阳市科技局项目(No 2015KJ15)；南华大学“十二五”科技创新团队基金；南华大学留学回国人员启动基金(No 2013XQD52)；南华大学大学生研究性学习和创新性实验计划项目(2014,2015);国家自然科学基金资助项目(No 81600291)；湖南省研究生科研创新项目(No CX2016B474)

欧 露(1989-)，女，硕士生，研究方向：细胞遗传学，E-mail：985800843@qq.com； 麻燕妮(1994-)，女，本科生，研究方向：脂蛋白与动脉粥样硬化，共同第一作者，E-mail：475238299@qq.com； 田 英(1963-)，男，博士，教授，研究方向：脂蛋白与动脉粥样硬化，通讯作者，E-mail：uscty@163.com； 龙石银(1973-)，女，博士，教授，研究方向：脂蛋白与动脉粥样硬化，通讯作者,E-mail： longshiyin@126.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.02.019

A

1001-1978(2017)02-0243-06

R329.24；R341.35；R392.11；R972.6；R977.6

关分子机制，为其临床用药提供指导。方法 采用油红O染色观察细胞内脂质蓄积；酶法检测细胞内胆固醇含量；荧光流式检测细胞表面LDLR丰度分布；qPCR及Western blot检测LDLR、SREBP2以及PCSK9的mRNA及蛋白含量变化。结果 经烟酸处理的HepG2细胞，油红O阳性细胞数及细胞内红染脂滴增多，细胞内TC、FC水平明显增高(P<0.05)；LDLR mRNA含量无差异(P>0.05)，而细胞膜表面LDLR分布丰度及细胞内LDLR的含量明显增加(P<0.05)； 烟酸对SREBP2的表达无影响，却能明显下调PCSK9的表达。结论 烟酸可能通过下调PCSK9的表达，减少PCSK9成熟体蛋白含量，使得LDLR降解减少，进而增加LDLR含量，促进HepG2细胞摄取LDL-C。