风味水豆豉发酵菌种的筛选与鉴定

2017-02-27陈兴林黄建敏

浙江农业科学 2017年2期

关键词：豆豉菌体枯草

陈兴林，俞露，黄建敏

(1.贵州省质量技术监督局，贵州贵阳 550012； 2.贵州大学酿酒与食品工程学院，贵州贵阳 550025)

风味水豆豉发酵菌种的筛选与鉴定

陈兴林1，俞露2*，黄建敏2

(1.贵州省质量技术监督局，贵州贵阳 550012； 2.贵州大学酿酒与食品工程学院，贵州贵阳 550025)

为给贵州省风味水豆豉工业化生产提供可选的生产菌株，从传统发酵的细菌型水豆豉中分离筛选适于豆豉生产的菌种，并对分离出的优势菌株进行产气筛选，优选出不产气的3株优势菌株，经鉴定发现3株菌株均为枯草芽孢杆菌。

水豆豉；发酵；菌种； PCR；鉴定

豆豉古名“幽菽”，古代称大豆为“菽”，“幽”是指把大豆煮熟后幽闭发酵的意思[1]，至秦朝始更名为豆豉。豆豉是以黄豆为原料，经过微生物发酵制得的传统发酵食品，味道鲜美，既能调味又能入药，长期食用可开胃增食、祛风散寒、消积化滞[2]。豆豉发酵中微生物起着至关重要的作用，孙森等[3]对天然制曲豆豉发酵过程中菌相的变化进行了研究，结果表明，优势菌群为乳酸菌、芽孢杆菌和酵母菌。

水豆豉是细菌型豆豉，是由黄豆经过细菌作用发酵而成的酿造调味食品，因含水量大，故产品呈湿态，在堆积发酵过程中发生水解作用产生一些特殊气味[4]。水豆豉营养丰富，含有丰富的蛋白质，维生素和矿物质[4-7]。日本的“纳豆”与我国的水豆豉是相似的发酵食品，它最早是在唐朝由鉴真和尚带到日本的。豆豉起源于民间，植根于民间，发展于民间，它以特殊的工艺、丰富的营养、独特的风味深受广大消费者的喜爱，并越来越受到人们的重视。

鄯晋晓等[2]研究表明，细菌型豆豉中的主要菌种为枯草芽孢杆菌，它能形成大量淀粉酶和蛋白酶，是细菌型豆豉发酵中必不可少的菌种。张建华[8]对自然发酵曲霉型豆豉曲中微生物的分布进行了研究，结果表明，自然发酵豆豉中主要的微生物菌群是细菌和霉菌。蒋立文等[9]利用平板稀释分离方法，确定了浏阳豆豉制曲中主要微生物是霉菌类和细菌类。

本文对贵州细菌型水豆豉中的优势发酵菌群进行了分离、筛选和鉴定，以期为后续的菌粉制备和发酵工艺等方面的深入研究提供一定的理论基础，为贵州省水豆豉产品的工业化和产业化奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

水豆豉，贵州水巷子食品有限公司生产；纳豆菌粉，北京川秀科技有限公司；黄豆、食盐、姜、辣椒、花椒、土豆、西红柿、面粉均采购自贵阳市花溪合力超市。

1.2 方法

1.2.1 菌株分离纯化

用灭菌后的玻璃瓶从发酵车间分别采集发酵半成品样品各500 g(发酵0、6、12、24、48 h)，采用稀释涂布分离法进行分离。分别称取25 g豆豉样品，无菌操作移入225 mL灭菌0.9% NaCl中，然后依次进行梯度稀释(梯度稀释为10-4、10-5、10-6、10-7、10-8和10-9)，再选择适宜的稀释度，取200 μL涂布于PAD、NB和MRS平板上。每个稀释度做3个平行。经培养后，挑取不同形态的单菌落，经多次划线纯化后得到纯菌株，再观察菌落形态和菌体形态，选择具有代表性的菌株进行生理生化鉴定试验。

1.2.2 菌株的鉴定

菌体形态特征。将菌体进行革兰氏染色，用显微镜观察个体形态，并用目镜测微尺测量菌体大小。

菌落形态鉴定。将分离菌株点种于牛肉膏蛋白胨培养基上，37 ℃培养1 d，形成菌落，观察菌落的大小、质地、形状等。

生理生化鉴定。通过糖类发酵实验、甲基红实验、吲哚实验、V-P实验等，进行生理生化鉴定，参照《伯杰士鉴定手册》(第八版)鉴定到种属。

分子生物学鉴定。采用细菌基因组DNA提取试剂盒(天根)提取基因组DNA，然后，以基因组DNA为模板，用特异性引物扩增细菌16S rDNA序列，PCR引物序列5′-GAGGAACATCAGTGGCGA AGG-3′、5′-CCAGGCGGCGAACTTAACG-3′。反应体系40 μL，包括rTaq酶(含buffer)20 μL，DNA模板4 μL(100 ng)，上、下游引物(10 mmol·L-1)各0.8 μL，ddH2O 14.4 μL。反应程序为95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30个循环；72 ℃ 5 min。

16S rDNA序列检测。取10 μL 16S rDNA PCR产物用1%的琼脂糖凝胶，100 V电泳40 min检测后，剩余的PCR产物送英骏检测中心测序。

2 结果与分析

2.1 菌株

在选择性分离PAD、NB和MRS平板上，仅MRS平板出现菌落生长，分离纯化得到4株菌株，并命名为A1、A2、A3、A4。

2.2 菌体、菌落形态

菌株A1为革兰氏阴性菌，呈杆状，形状不规则，中端孢生，菌落呈乳白色，菌落表面边缘干燥，菌落直径2.6 mm。菌株A2为革兰氏阴性菌，呈短杆状，形状为圆形或不规则，菌落呈乳白色，菌落表面湿润，菌落直径3.0 mm。菌株A3为革兰氏阴性菌，呈杆状，形状为圆形，中端孢生，菌落呈乳白色，菌落表面边缘湿润，菌落直径3.8 mm。菌株A4为革兰氏阴性菌，呈杆状，形状为圆形或椭圆形，菌落呈粉红色，菌落表面边缘干燥，菌落直径1.8 mm。菌体菌落形态见图1、图2。

图1 各菌株菌落的形态

图2 各菌株菌体的形态

2.3 生理生化

以枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)为对照菌种，对上述菌种进行部分生理生化特征的测定以及糖发酵实验，生理生化实验包括V-P测定、吲哚实验、甲基红实验，结果(表1)表明，A3号菌种与参照菌种的生理生化特征相似。根据参考文献[10-11]，初步确定4株菌种均为枯草芽孢杆菌属。同时还做了产气实验，发现A4号菌株有产气现象，不适合在实际生产中运用。

表1 各菌株的生理生化实验结果

注：+表示阳性，-表示阴性。

2.4 分子生物学

在NCBI网站中使用blast在Genebank/EMBL/DDBJ基因库中，将获得的16S rDNA序列进行同源性搜索。结果表明，A1、A2、A3菌株的16S rDNA序列分别与枯草芽抱杆菌Bacillussubtilis168、BacillusvelezensisFZB42、Bacillusatrophaeus1942的16S rDNA序列同源性高达99%(表2)，表明A1、A2和A3菌株均为枯草芽孢杆菌。

表2 Genebank中各菌株16S rDNA序列

3 小结

本实验以贵州省风味水豆豉为材料，通过分离纯化得到4株优势菌株，并命名为A1、A2、A3、A4。从菌落的形态上看，菌株呈乳白色或粉红色，圆形或不规则，属于枯草芽孢杆菌。通过生理生化实验，初步确定4株菌株为枯草芽孢杆菌属，4号菌株有产气现象，会对产品的贮藏造成不利的影响，不适合在实际生产中运用。再对不产气的3株菌株进行基因组DNA的提取纯化及16S rDNA序列分析，结果表明，A1、A2和A3菌株均为枯草芽孢杆菌。

[1] 穆慧玲, 李里特. 豆豉的保健功能及开发价值[J]. 农产品加工, 2008 (11): 30-32.

[2] 鄯晋晓, 盛占武, 蒋和体, 等. 细菌型豆豉的研究现状及发展前景[J]. 中国酿造, 2007 (3): 1-4.

[3] 孙森, 宋俊梅, 曲静然. 豆豉后发酵过程中微生物菌相的变化[J]. 中国食品添加剂, 2008 (2): 139-143.

[4] 赵欣, 冉龙江, 邵林楠. 水豆豉和纳豆的理化特性及抗突变效果的比较[J]. 潍坊工程职业学院学报, 2008, 21(2): 49-50.

[5] 石彦国. 大豆制品工艺学 [M]. 2版.北京：中国轻工业出版社, 2005: 11-44.

[6] 黄欣, 邓放明. 豆豉的研究进展[J]. 中国食物与营养, 2006 (11): 20-22.

[7] 赵德安. 中国豆豉[J]. 中国酿造，2003 (4): 36-40.

[8] 张建华. 曲霉型豆豉发酵机理及其功能性的研究[D]. 北京: 中国农业大学, 2003.

[9] 蒋立文, 夏波. 浏阳豆豉发酵微生物的初步研究[J]. 中国酿造, 2004 (12): 11-12.

[10] 刘慧. 现代食品微生物学实验技术[M]. 北京: 中国轻工业出版社, 2008: 261-262.

[11] 赵斌, 何绍江. 微生物学实验[M]. 北京: 科学出版社, 2002: 255.

(责任编辑：侯春晓)